Dankon pro via vizito al Nature.com. La versio de retumilo, kiun vi uzas, havas limigitan subtenon por CSS. Por plej bonaj rezultoj, ni rekomendas, ke vi uzu pli novan version de via retumilo (aŭ malŝaltu la Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Dume, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj aŭ JavaScript.
La malkovro kaj utila uzo de naturaj produktoj povas helpi plibonigi homan vivon. Kemiaĵoj, kiuj inhibicias plantkreskon, estas vaste uzataj kiel herbicidoj por kontroli fiherbojn. Pro la bezono uzi malsamajn specojn de herbicidoj, necesas identigi kombinaĵojn kun novaj agadmekanismoj. En ĉi tiu studo, ni malkovris novan N-alkoksipirolan kombinaĵon, kumamonamidon, el Streptomyces werraensis MK493-CF1 kaj establis la kompletan sintezprocezon. Per biologiaj agadanalizoj, ni malkovris, ke urs-monoamata acido estas sinteza intermediato de urs-monoamido kaj potenciala...plantkreskiga inhibitoroKrome, ni evoluigis diversajn derivaĵojn de urbenona acido, inkluzive de la urbeniloks-derivaĵo (UDA), kiu havas altan herbicidan agadon sen negative influi la kreskon de HeLa-ĉeloj. Ni ankaŭ trovis, ke derivaĵoj de urmotona acido interrompas plantmikrotubulojn; krome, KAND influas aktinajn filamentojn kaj induktas ĉelmorton; Ĉi tiuj multfacetaj efikoj diferencas de tiuj de konataj mikrotubulaj inhibiciiloj kaj sugestas novan agmekanismon por ursona acido, kiu reprezentas gravan avantaĝon en la evoluigo de novaj herbicidoj.
La malkovro kaj praktika apliko de utilaj naturaj produktoj kaj iliaj derivaĵoj estas rimedo por plibonigi la kvaliton de homa vivo. Sekundaraj metabolitoj produktitaj de mikroorganismoj, plantoj kaj insektoj kondukis al gravaj progresoj en medicino kaj agrikulturo. Multaj antibiotikoj kaj kontraŭleŭkemiaj medikamentoj estis evoluigitaj el naturaj produktoj. Krome, diversaj specoj depesticidoj, fungicidoj kaj herbicidoj estas ekstraktitaj el ĉi tiuj naturaj produktoj por uzo en agrikulturo. Aparte, herbicidoj por fiherbokontrolo estas gravaj iloj por pliigi kultivaĵojn en moderna agrikulturo, kaj diversaj specoj de kombinaĵoj jam estas uzataj komerce. Pluraj ĉelaj procezoj en plantoj, kiel fotosintezo, aminoacida metabolo, ĉelmura sintezo, reguligo de mitozo, fitohormona signalado aŭ proteinsintezo, estas konsiderataj tipaj celoj de herbicidoj. Kombinaĵoj, kiuj inhibicias mikrotubulan funkcion, estas ofta klaso de herbicidoj, kiuj influas plantkreskon per influado de mitoza reguligo2.
Mikrotubuloj estas komponantoj de la citoskeleto kaj estas vaste konservitaj en eŭkariotaj ĉeloj. La tubulina heterodimero konsistas el α-tubulino kaj β-tubulino, kiuj formas liniajn mikrotubulajn protofilamentojn, kun 13 protofilamentoj formantaj cilindran strukturon. Mikrotubuloj ludas plurajn rolojn en plantĉeloj, inkluzive de determinado de ĉelformo, ĉeldividiĝo kaj intraĉela transporto3,4. Plantĉeloj enhavas mikrotubulojn sub la interfaza plasmomembrano, kaj oni supozas, ke ĉi tiuj tiel nomataj kortikaj mikrotubuloj kontrolas la organizadon de celulozaj mikrofibriloj per la reguligo de celulozaj sintazaj kompleksoj4,5. Kortikaj mikrotubuloj de radikaj epidermaj ĉeloj, ĉeestantaj en la zono de rapida plilongigo de la radikpinto, situas laterale, kaj celulozaj mikrofibroj sekvas ĉi tiujn mikrotubulojn kaj limigas la direkton de ĉelkresko, tiel antaŭenigante anizotropan ĉelplilongigon. Tial, la funkcio de mikrotubuloj estas proksime rilata al planta morfologio. Aminoacidaj anstataŭigoj en genoj kodantaj tubulinon kaŭzas misprezenton de kortikaj mikrotubulaj aroj kaj maldekstra- aŭ dekstra-flankan kreskon en Arabidopsis 6,7. Simile, mutacioj en mikrotubul-asociitaj proteinoj, kiuj reguligas mikrotubulan dinamikon, ankaŭ povas konduki al distordita radikokresko8,9,10,11,12,13. Krome, traktado per mikrotubul-interrompantaj herbicidoj kiel disopiramido, ankaŭ konata kiel pretilakloro, ankaŭ kaŭzas maldekstra-flankan oblikvan radikokreskon14. Ĉi tiuj datumoj indikas, ke preciza reguligo de mikrotubula funkcio estas kritika por determini la direkton de plantkresko.
Diversaj tipoj de mikrotubulaj inhibiciiloj estis malkovritaj, kaj ĉi tiuj medikamentoj faris signifajn kontribuojn al esplorado pri citoskeleto, same kiel al agrikulturo kaj medicino2. Aparte, orizalino, dinitroanilinaj kombinaĵoj, disopiramido, benzamid-rilataj kombinaĵoj, kaj iliaj analogoj povas inhibicii mikrotubulan funkcion kaj tiel inhibicii plantkreskon. Tial ili estas vaste uzataj kiel herbicidoj. Tamen, ĉar mikrotubuloj estas grava komponanto de plantaj kaj bestaj ĉeloj, la plej multaj mikrotubulaj inhibiciiloj estas citotoksaj por ambaŭ ĉeltipoj. Tial, malgraŭ ilia agnoskita utileco kiel herbicidoj, limigita nombro da kontraŭmikrotubulaj agentoj estas uzataj por praktikaj celoj.
Streptomyces estas genro de la familio Streptomyces, kiu inkluzivas aerobajn, gram-pozitivajn, filamentajn bakteriojn kaj estas vaste konata pro sia kapablo produkti vastan gamon da sekundaraj metabolitoj. Tial, ĝi estas konsiderata unu el la plej gravaj fontoj de novaj biologie aktivaj naturaj produktoj. En la nuna studo, ni malkovris novan kombinaĵon nomatan kumamonamido, kiu estis izolita de Streptomyces werraensis MK493-CF1 kaj S. werraensis ISP 5486. Uzante spektran analizon kaj plenan spektran analizon, la strukturo de kumamonamido estis karakterizita kaj ĝia unika N-alkoksipirola skeleto estis determinita. Ursmona acido, sinteza intermediato de ursmonoamido kaj ĝiaj derivaĵoj, estis trovita inhibicii la kreskon kaj ĝermadon de la populara modelplanto Arabidopsis thaliana. En studo pri strukturo-aktiveca rilato, ni trovis, ke kombinaĵo kun C9 modifita al ursona acido, nomata noniloksia derivaĵo de ursona acido (KAND), signife plifortigas la inhibician efikon sur kreskon kaj ĝermadon. Rimarkinde, la nove malkovrita plantkreskiga inhibiciilo ankaŭ influis la kreskon de tabako kaj hepatiko kaj ne estis citotoksa por bakterioj aŭ HeLa-ĉeloj. Krome, iuj urmotonacidaj derivaĵoj induktas distorditan radikan fenotipon, kio implicas, ke ĉi tiuj derivaĵoj rekte aŭ nerekte influas mikrotubulojn. Konforme al ĉi tiu ideo, niaj observoj de mikrotubuloj markitaj aŭ imunohistokemia aŭ per fluoreskaj proteinoj indikas, ke KAND-traktado depolimerigas mikrotubulojn. Krome, traktado per kumamotonacidaj derivaĵoj interrompis aktinajn mikrofilamentojn. Tiel, ni malkovris novan plantkreskigan inhibiciilon, kies unika agadmekanismo implikas la detruon de la citoskeleto.
Trostreĉiĝo MK493-CF1 estis izolita el grundo en Shinagawa-ku, Tokio. Trostreĉiĝo MK493-CF1 formis bone branĉitan stroman micelion. La parta sekvenco de la 16S ribosomal RNA geno (1422 bp) estis determinita. Ĉi tiu trostreĉiĝo estas tre simila al S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipa trostreĉiĝo, 99.93%). Surbaze de ĉi tiu rezulto, oni determinis, ke ĉi tiu trostreĉiĝo estas proksime parenca al la tipa trostreĉiĝo de S. werraensis. Tial, ni provizore nomis ĉi tiun trostreĉiĝon S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T ankaŭ produktas la samajn bioaktivajn komponaĵojn. Ĉar estis malmulte da frua esplorado pri akiro de naturaj produktoj el ĉi tiu mikroorganismo, plia kemia esplorado estis farita. Post kultivado de S. werraensis MK493-CF1 sur hordea medio per solidstata fermentado je 30°C dum 14 tagoj, la medio estis ekstraktita per 50% EtOH. 60 ml da specimeno estis sekigitaj por akiri 59.5 mg da kruda ekstrakto. La kruda ekstrakto estis submetita al inversfaza HPLC por doni N-metoksi-1H-pirolo-2-karboksamidon (1, nomita kumamonamido, 36.0 mg). La tuta kvanto de 1 estas proksimume 60% de la kruda ekstrakto. Tial, ni decidis detale studi la ecojn de kumamotoamido 1.
Kumamonamido 1 estas blanka amorfa pulvoro kaj alt-rezolucia mas-spektrometrio (HRESIMS) konfirmas C6H8N2O2 (Fig. 1). La C2-anstataŭigita pirola fragmento de ĉi tiu kombinaĵo estas karakterizita per δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH en 1H NMR-spektro: 4.5 Hz, H-5) kaj δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), kaj la 13C NMR-spektro montras la ĉeeston de kvar sp2-karbonatomoj. La ĉeesto de amida grupo ĉe la C2-pozicio estis taksita per HMBC-korelacio de la C-3-protono al la amida karbonila karbono je δC 161.1. Krome, 1H kaj 13C NMR-pintoj je δH 4.10 (3H, S) kaj δC 68.3 indikas la ĉeeston de N-metoksaj grupoj en la molekulo. Kvankam la ĝusta pozicio de la metoksaj grupoj ankoraŭ ne estis determinita per spektroskopa analizo kiel ekzemple plifortigita diferenca spektroskopio kaj nuklea Overhauser-mallongigo (NOEDF), N-metoks-1H-pirolo-2-karboksamido fariĝis la unua kandidata kombinaĵo.
Por determini la ĝustan strukturon de 1, oni faris totalan sintezon (Fig. 2a). Traktado de komerce havebla 2-aminopiridino 2 per m-CPBA rezultigis la korespondan N-oksidon 3 kun kvanta rendimento. Post la 2-aminoazidado de 2, la ciklokondensada reakcio priskribita de Abramovich estis efektivigita en benzeno je 90°C por akiri la deziratan 1-hidroksi-1H-pirolo-2-karbonitrilon 5 en gramoj. Rapido 60% (du etapoj). 15,16. Metilado kaj hidrolizo de 4 poste donis 1-metoksi-1H-pirolo-2-karboksilan acidon (nomata "kumotona acido", 6) kun bona rendimento (70%, du etapoj). Fine, amidigado per acida klorida intermediato 6 uzante akvan amoniakon donis Kumamoto-amidon 1 kun 98% rendimento. Ĉiuj spektraj datumoj de sintezita 1 estis similaj al izolita 1, do la strukturo de 1 estis determinita;
Ĝenerala sintezo kaj analizo de la biologia aktiveco de urbenamido kaj urbena acido. (a) Totala sintezo de Kumamoto-amido. (b) Septagaj sovaĝ-tipa Arabidopsis Columbia (Col) plantidoj estis kultivitaj sur Murashige kaj Skoog (MS) platoj enhavantaj kumamonamidon 6 aŭ kumamonamidon 1 je la indikitaj koncentriĝoj. Skalbreto = 1 cm.
Unue, ni taksis la biologiajn aktivecojn de urbenamido kaj ĝiaj intermediatoj rilate al ilia kapablo moduli plantkreskon. Ni aldonis diversajn koncentriĝojn de ursmonamido 1 aŭ ursona acido 6 al MS-agara medio kaj kultivis Arabidopsis thaliana plantidojn sur ĉi tiu medio. Ĉi tiuj provoj montris, ke altaj koncentriĝoj (500 μM) de 6 inhibis radikkreskon (Fig. 2b). Poste, ni generis diversajn derivaĵojn anstataŭigante la N1-pozicion de 6 kaj faris studojn pri strukturo-aktiveco sur ili (la analoga sintezprocezo estas priskribita en la Aldona Informo (SI)). Arabidopsis-plantidoj estis kultivitaj sur medio enhavanta 50 μM da ursonacidaj derivaĵoj, kaj la radiklongo estis mezurita, kiel montrite en la bildo. Kiel montrite en Figuroj 3a, b kaj S1, kumamacidoj havas malsamajn longojn de liniaj alkoksilaj ĉenoj (9, 10, 11, 12 kaj 13) aŭ grandaj alkoksilaj ĉenoj (15, 16 kaj 17) ĉe la N1-pozicio. La derivaĵoj montris signifan inhibicion de radikkresko. Krome, ni trovis, ke apliko de 200 μM 10, 11, aŭ 17 inhibis ĝermadon (Figuroj 3c kaj S2).
Studo de la strukturo-aktiveca rilato de Kumamoto-amido kaj rilataj kombinaĵoj. (a) Strukturo kaj sinteza skemo de analogoj. (b) Kvantigo de radiklongo de 7-tagaj plantidoj kultivitaj sur MS-medio kun aŭ sen 50 μM da kumamonamidaj derivaĵoj. Asteriskoj indikas signifajn diferencojn kun ŝajntraktado (t-testo, p< 0,05). n>18. Datumoj estas montritaj kiel meznombro ± norma devio. nt signifas "ne testita" ĉar pli ol 50% de la semoj ne ĝermis. (c) Kvantigo de ĝermadofteco de traktitaj semoj inkubaciitaj dum 7 tagoj en MS-medio kun aŭ sen 200 μM kumamonamido kaj rilataj kombinaĵoj. Asteriskoj indikas signifajn diferencojn kun ŝajntraktado (ĥi-kvadrata testo). n=96.
Interese, la aldono de alkilaj flankĉenoj pli longaj ol C9 reduktis la inhibician agadon, sugestante ke kumamotoacidaj-rilataj kombinaĵoj postulas flankĉenojn de certa grandeco por montri sian biologian agadon.
Ĉar analizo de la strukturo-aktiveca rilato montris, ke C9 estis modifita al ursona acido kaj la noniloksia derivaĵo de ursona acido (ĉi-poste nomata KAND 11) estis la plej efika plantkreskiga inhibiciilo, ni faris pli detalan karakterizadon de KAND 11. Traktado de Arabidopsis per 50 μM KAND 11 preskaŭ tute malhelpis ĝermadon, dum pli malaltaj koncentriĝoj (40, 30, 20, aŭ 10 μM) de KAND 11 inhibis radikkreskon doz-dependan manieron (Fig. 4a, b). Por testi ĉu KAND 11 influas la viveblon de la radika meristemo, ni ekzamenis radikmeristemojn makulitajn per propidiuma jodido (PI) kaj mezuris la areon de la meristemo. La grandeco de la meristemo de plantidoj kreskigitaj sur medio enhavanta 25 μM KAND-11 estis 151,1 ± 32,5 μm, dum la grandeco de la meristemo de plantidoj kreskigitaj sur kontrolmedio enhavanta DMSO estis 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), kio indikas, ke KAND-11 restarigas ĉelan agadon. disvastiĝo. Radika meristemo. Konforme al tio, KAND 11-traktado reduktis la kvanton de la ĉeldividiĝa markilo CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signalo en la radika meristemo (Fig. 4e) 17. Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke KAND 11 inhibas radikan kreskon per redukto de ĉelmultobliĝa agado.
Analizo de la inhibicia efiko de derivaĵoj de urbenonata acido (urbeniloksiaj derivaĵoj) sur kreskon. (a) 7-tagaj sovaĝtipaj Col-plantidoj kultivitaj sur MS-platoj kun la indikitaj koncentriĝoj de KAND 11. Skalbreto = 1 cm. (b) Kvantigo de radiklongo. Literoj indikas signifajn diferencojn (Tukey HSD-testo, p< 0,05). n>16. Datumoj estas montritaj kiel meznombro ± norma devio. (c) Konfokusa mikroskopio de per propidium-jodido koloritaj sovaĝ-tipaj Col-radikoj kreskigitaj sur MS-platoj kun aŭ sen 25 μM KAND 11. Blankaj krampoj indikas radikan meristemon. Skalbreto = 100 µm. (d) Kvantigo de la grandeco de la radika meristemo (n = 10 ĝis 11). Statistikaj diferencoj estis determinitaj per t-testo (p< 0,05). La stangoj reprezentas la averaĝan grandecon de la meristemo. (e) Mikroskopio per diferenciga interfera kontrasto (DIC) de radika meristemo enhavanta la CDKB2-konstrukcion; 1pro: CDKB2; 1-GUS kolorigita kaj kolorigita sur 5-tagaj plantidoj kreskigitaj sur MS-platoj kun aŭ sen 25 µM KAND-analizo.
La fitotokseco de KAND 11 estis plue testita uzante alian dikotiledonan planton, tabakon (Nicotiana tabacum), kaj gravan modelan organismon de tera planto, hepatikon (Marchantia polymorpha). Kiel en la kazo de Arabidopsis, tabakaj SR-1-plantidoj kultivitaj sur medio enhavanta 25 μM da KAND 11 produktis pli mallongajn radikojn (Fig. 5a). Plie, 40 el 48 semoj ĝermis sur platoj enhavantaj 200 μM da KAND 11, dum ĉiuj 48 semoj ĝermis sur imite traktitaj medioj, indikante ke pli altaj koncentriĝoj de KAND estis signifaj (p< 0,05; ĥi-testo - kvadrato) inhibis la ĝermadon de tabako. (Fig. 5b). Krome, la koncentriĝo de KAND 11, kiu inhibis bakterian kreskon en hepatiko, estis simila al la efika koncentriĝo en Arabidopso (Fig. 5c). Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke KAND 11 povas inhibi la kreskon de diversaj plantoj. Ni poste esploris la eblan citotoksecon de ursaj monoamid-rilataj kombinaĵoj en aliaj organismoj, nome homaj HeLa-ĉeloj kaj Escherichia coli-bakterio DH5α, kiel reprezentantoj de pli altaj bestaj kaj bakteriaj ĉeloj, respektive. En serio de ĉelmultobliĝaj analizoj, ni observis, ke kumamonamido 1, kumamonamida acido 6, kaj KAND 11 ne influis la kreskon de HeLa aŭ E. coli-ĉeloj je koncentriĝoj de 100 μM (Fig. 5d,e).
Kreskinhibicio de KAND 11 en ne-Arabidopsiaj organismoj. (a) Du-semajnaj sovaĝ-tipaj SR-1 tabakaj plantidoj estis kultivitaj sur vertikale poziciigitaj MS-platoj enhavantaj 25 μM KAND 11. (b) Du-semajnaj sovaĝ-tipaj SR-1 tabakaj plantidoj estis kultivitaj sur horizontale poziciigitaj MS-platoj enhavantaj 200 μM KAND 11. (c) Du-semajnaj sovaĝ-tipaj Tak-1 hepatikaj burĝonoj kultivitaj sur Gamborg B5-platoj kun la indikitaj koncentriĝoj de KAND 11. Ruĝaj sagoj indikas sporojn, kiuj ĉesis kreski ene de la du-semajna inkubacia periodo. (d) Ĉelmultipliĝa analizo de HeLa-ĉeloj. La nombro de vivkapablaj ĉeloj estis mezurita je fiksitaj tempintervaloj uzante ĉelkalkulan ilaron 8 (Dojindo). Kiel kontrolo, HeLa-ĉeloj estis traktitaj per 5 μg/ml aktinomicino D (Act D), kiu inhibicias RNA-polimerazan transskribon kaj kaŭzas ĉelmorton. Analizoj estis faritaj trioble. (e) E. coli ĉelmultipliĝa analizo. E. coli kresko estis analizita per mezurado de OD600. Kiel kontrolo, ĉeloj estis traktitaj per 50 μg/ml ampicilino (Amp), kiu inhibicias la sintezon de bakteriaj ĉelmuroj. Analizoj estis faritaj trioble.
Por deĉifri la mekanismon de agado de citotokseco kaŭzita de uramid-rilataj kombinaĵoj, ni reanalizis derivaĵojn de urmotona acido kun moderaj inhibiciaj efikoj, kiel montrite en la bildo. Kiel montrite en Figuroj 2b, 6a, plantidoj kultivitaj sur agaragarplatoj enhavantaj altajn koncentriĝojn (200 μM) de urmotona acido 6 produktis pli mallongajn kaj maldekstren kurbajn radikojn (θ = – 23,7 ± 6,1), dum plantidoj kultivitaj sur la kontrolmedio, plantidoj produktis preskaŭ rektajn radikojn (θ = – 3,8 ± 7,1). Ĉi tiu karakteriza oblikva kresko estas konata kiel rezulto de misfunkcio de kortikalaj mikrotubuloj14,18. Konforme al ĉi tiu trovo, la mikrotubul-malstabiligaj drogoj disopiramido kaj orizalino induktis similan radikan kliniĝon sub niaj kreskokondiĉoj (Figuroj 2b, 6a). Samtempe, ni testis derivaĵojn de urmotona acido kaj selektis plurajn el ili, kiuj, ĉe certaj koncentriĝoj, induktis oblikvan radikan kreskon. La kombinaĵoj 8, 9, kaj 15 ŝanĝis la direkton de radikkresko je 75 μM, 50 μM, kaj 40 μM, respektive, indikante ke ĉi tiuj kombinaĵoj povas efike malstabiligi mikrotubulojn (Fig. 2b, 6a). Ni ankaŭ testis la plej potencan ursolacidan derivaĵon, KAND 11, je pli malalta koncentriĝo (15 µM) kaj trovis, ke apliko de KAND 11 inhibis radikkreskon kaj ke la direkto de radikkresko estis malebena, kvankam ili emis deklivi maldekstren (Figuro C3). Ĉar pli altaj koncentriĝoj de mikrotubul-malstabiligaj drogoj foje inhibicias plantkreskon anstataŭ kaŭzi radikan kliniĝon, ni poste taksis la eblecon, ke KAND 11 influas mikrotubulojn per observado de kortikaj mikrotubuloj en radikaj epidermaj ĉeloj. Imunohistokemio uzanta kontraŭ-β-tubulinajn antikorpojn en epidermaj ĉeloj de plantidaj radikoj traktitaj per 25 μM KAND 11 montris la malaperon de preskaŭ ĉiuj kortikaj mikrotubuloj en epidermaj ĉeloj en la plilongiga zono (Fig. 6b). Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke kumamotona acido kaj ĝiaj derivaĵoj agas rekte aŭ nerekte sur mikrotubulojn por interrompi ilin kaj ke ĉi tiuj kombinaĵoj estas novaj mikrotubulaj inhibiciiloj.
Ursona acido kaj ĝiaj derivaĵoj ŝanĝas kortikajn mikrotubulojn en Arabidopsis thaliana. (a) Radika inklina angulo mezurita en la ĉeesto de diversaj urmotonacidaj derivaĵoj ĉe la indikitaj koncentriĝoj. La efikoj de du komponaĵoj konataj pro inhibicio de mikrotubuloj: disopiramido kaj orizalino ankaŭ estis analizitaj. La enmetitaĵo montras la normon uzatan por mezuri radikan kreskoperspektivon. Asteriskoj indikas signifajn diferencojn kun ŝajntraktado (t-testo, p< 0,05). n>19. Skalbreto = 1 cm. (b) Kortikaj mikrotubuloj en epidermaj ĉeloj en la plilongiga zono. Mikrotubuloj en sovaĝ-tipaj radikoj de Arabidopsis Col kreskigitaj sur MS-platoj kun aŭ sen 25 μM KAND 11 estis bildigitaj per imunohistokemia tinkturado uzante β-tubulinajn primarajn antikorpojn kaj Alexa Fluor-konjugitajn sekundarajn antikorpojn. Skalbreto = 10 µm. (c) Mitoza strukturo de mikrotubuloj en la radika meristemo. Mikrotubuloj estis bildigitaj uzante imunohistokemian tinkturadon. Mitozaj strukturoj, inkluzive de profazaj zonoj, spindeloj kaj fragmoplastoj, estis kalkulitaj el konfokusaj bildoj. Sagoj indikas mitozajn mikrotubulajn strukturojn. Asteriskoj indikas signifajn diferencojn kun ŝajntraktado (t-testo, p< 0,05). n>9. Skalbreto = 50 µm.
Kvankam Ursa havas la kapablon interrompi la funkcion de mikrotubuloj, ĝia agadmekanismo supozeble diferencas de tipaj depolimerigaj agentoj de mikrotubuloj. Ekzemple, pli altaj koncentriĝoj de depolimerigaj agentoj de mikrotubuloj kiel disopiramido kaj orizalino induktas anizotropan ekspansion de epidermaj ĉeloj, dum KAND 11 ne faras tion. Krome, kunapliko de KAND 11 kaj disopiramido rezultigis kombinitan respondon de disopiramid-induktita radika kresko kaj oni observis inhibicion de kreskado induktita de KAND 11 (Fig. S4). Ni ankaŭ analizis la respondon de la trosentema mutaciulo disopiramido 1-1 (phs1-1) al KAND 11. phs1-1 havas ne-kanonikan punktan mutacion de tubulina kinazo kaj produktas pli mallongajn radikojn kiam traktita per disopiramido9,20. phs1-1-mutaciaj plantidoj kultivitaj sur agaragara medio enhavanta KAND 11 havis pli mallongajn radikojn similajn al tiuj kultivitaj sur disopiramido (fig. S5).
Krome, ni observis mitozajn mikrotubulajn strukturojn, kiel ekzemple profazajn zonojn, spindelojn kaj fragmoplastojn, en la radika meristemo de plantidoj traktitaj per KAND 11. Kongrue kun la observoj por CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, oni observis signifan malpliiĝon en la nombro de mitozaj mikrotubuloj (Fig. .6c).
Por karakterizi la citotoksecon de KAND 11 ĉe subĉela rezolucio, ni traktis tabakajn BY-2 suspendajn ĉelojn per KAND 11 kaj observis ilian respondon. Ni unue aldonis KAND 11 al BY-2 ĉeloj esprimantaj TagRFP-TUA6, kiu fluoreske etikedas mikrotubulojn, por taksi la efikon de KAND 11 sur kortikaj mikrotubuloj. La denseco de kortikaj mikrotubuloj estis taksita per bildanalizo, kiu kvantigis la procenton de citoskeletaj pikseloj inter citoplasmaj pikseloj. La rezultoj de la testo montris, ke post traktado per 50 μM aŭ 100 μM KAND 11 dum 1 horo, la denseco malpliiĝis signife al 0,94 ± 0,74% aŭ 0,23 ± 0,28%, respektive, dum la denseco de ĉeloj traktitaj per DMSO estis 1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Ĉi tiuj rezultoj kongruas kun la observado en Arabidopsis, ke KAND 11-traktado induktas depolimerigon de kortikaj mikrotubuloj (Fig. 6b). Ni ankaŭ ekzamenis la BY-2-linion kun GFP-ABD-markitaj aktinaj filamentoj post traktado kun la sama koncentriĝo de KAND 11 kaj observis, ke KAND 11-traktado interrompis la aktinajn filamentojn. Traktado kun 50 μM aŭ 100 μM KAND 11 dum 1 horo signife reduktis la densecon de aktinaj filamentoj al 1,20 ± 0,62% aŭ 0,61 ± 0,26%, respektive, dum la denseco en DMSO-traktitaj ĉeloj estis 1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Ĉi tiuj rezultoj kontrastas kun la efikoj de propilamido, kiu ne influas aktinajn filamentojn, kaj latrunkulino B, aktina depolimerigilo, kiu ne influas mikrotubulojn (SI-Figuro S6). Krome, traktado kun kumamonamido 1, kumamonamida acido 6, aŭ KAND 11 ne influis mikrotubulojn en HeLa-ĉeloj (SI-Figuro S7). Tiel, oni kredas, ke la agadmekanismo de KAND 11 diferencas de tiu de konataj citoskeletaj interrompantoj. Krome, nia mikroskopa observado de BY-2-ĉeloj traktitaj per KAND 11 rivelis la komencon de ĉelmorto dum KAND 11-traktado kaj montris, ke la proporcio de Evans-blu-makulitaj mortaj ĉeloj ne signife pliiĝis post 30 minutoj da KAND 11-traktado, dum post 90 minutoj da traktado per 50 μM aŭ 100 μM KAND, la nombro de mortaj ĉeloj pliiĝis al 43.7% aŭ 80.1%, respektive (Fig. 7c). Sume, ĉi tiuj datumoj indikas, ke la nova ursolacida derivaĵo KAND 11 estas plant-specifa citoskeleta inhibitoro kun antaŭe nekonata agadmekanismo.
KAND influas kortikajn mikrotubulojn, aktinajn filamentojn, kaj viveblecon de tabakaj BY-2-ĉeloj. (a) Bildigo de kortikaj mikrotubuloj en BY-2-ĉeloj en ĉeesto de TagRFP-TUA6. BY-2-ĉeloj traktitaj per KAND 11 (50 μM aŭ 100 μM) aŭ DMSO estis ekzamenitaj per konfokusa mikroskopio. La denseco de kortikalaj mikrotubuloj estis kalkulita el mikrografoj de 25 sendependaj ĉeloj. Literoj indikas signifajn diferencojn (Tukey HSD-testo, p< 0,05). Skalbreto = 10 µm. (b) Kortikaj aktinaj filamentoj en BY-2-ĉeloj bildigitaj en la ĉeesto de GFP-ABD2. BY-2-ĉeloj traktitaj per KAND 11 (50 μM aŭ 100 μM) aŭ DMSO estis ekzamenitaj per konfokusa mikroskopio. La denseco de kortikaj aktinaj filamentoj estis kalkulita el mikrografoj de 25 sendependaj ĉeloj. Literoj indikas signifajn diferencojn (Tukey HSD-testo, p< 0,05). Skalbreto = 10 µm. (c) Observado de mortaj BY-2-ĉeloj per Evans-blua tinkturfarbo. BY-2-ĉeloj traktitaj per KAND 11 (50 μM aŭ 100 μM) aŭ DMSO estis ekzamenitaj per helkampa mikroskopio. n=3. Skalbreto = 100 µm.
La malkovro kaj apliko de novaj naturaj produktoj kondukis al signifaj progresoj en diversaj aspektoj de homa vivo, inkluzive de medicino kaj agrikulturo. Historia esplorado estis efektivigita por akiri utilajn kombinaĵojn el naturaj rimedoj. Aparte, aktinomicetoj estas konataj kiel utilaj kiel kontraŭparazitaj antibiotikoj por nematodoj pro sia kapablo produkti diversajn sekundarajn metabolitojn kiel avermektino, la ĉefa kombinaĵo de ivermektino kaj bleomicino kaj ĝiaj derivaĵoj, uzataj medicine kiel kontraŭkancera agento21,22. Simile, diversaj herbicidaj kombinaĵoj estis malkovritaj el aktinomicetoj, kelkaj el kiuj jam estas uzataj komerce1,23. Tial, la analizo de aktinomicetaj metabolitoj por izoli naturajn produktojn kun dezirataj biologiaj aktivecoj estas konsiderata efika strategio. En ĉi tiu studo, ni malkovris novan kombinaĵon, kumamonamidon, el S. werraensis kaj sukcese sintezis ĝin. Ursona acido estas sinteza intermediato de urbenamido kaj ĝiaj derivaĵoj. Ĝi povas kaŭzi karakterizan radikkruliĝon, montri moderan ĝis fortan herbicidan agadon, kaj rekte aŭ nerekte damaĝi plantmikrotubulojn. Tamen, la mekanismo de agado de urmotona acido povas diferenci de tiu de ekzistantaj mikrotubulaj inhibitoroj, ĉar KAND 11 ankaŭ interrompas aktinajn filamentojn kaj kaŭzas ĉelmorton, sugestante reguligan mekanismon per kiu urmotona acido kaj ĝiaj derivaĵoj influas vastan gamon da citoskeletaj strukturoj.
Plia detala karakterizado de urbenonata acido helpos pli bone kompreni la agmekanismon de urbenonata acido. Aparte, la sekva celo estas taksi la kapablon de ursonata acido ligiĝi al reduktitaj mikrotubuloj por determini ĉu ursonata acido kaj ĝiaj derivaĵoj agas rekte sur mikrotubulojn kaj depolimerizas ilin, aŭ ĉu ilia agado rezultas en malstabiligo de mikrotubuloj. Krome, en la kazo kie mikrotubuloj ne estas rekta celo, identigi la aglokon kaj molekulajn celojn de ursonata acido sur plantĉeloj helpos plu kompreni la ecojn de rilataj kombinaĵoj kaj eblajn manierojn plibonigi herbicidan agadon. Nia bioaktiveca analizo rivelis la unikan citotoksan kapablon de ursonata acido sur la kresko de plantoj kiel Arabidopsis thaliana, tabako kaj hepatiko, dum nek E. coli nek HeLa-ĉeloj estis trafitaj. Malmulta aŭ neniu tokseco al bestaj ĉeloj estas avantaĝo de ursonacidaj derivaĵoj se ili estas evoluigitaj kiel herbicidoj por uzo en malfermaj agrikulturaj kampoj. Efektive, ĉar mikrotubuloj estas oftaj strukturoj en eŭkariotoj, ilia selektema inhibicio en plantoj estas ŝlosila postulo por herbicidoj. Ekzemple, propizamido, mikrotubula depolimeriga agento kiu rekte ligiĝas al tubulino kaj inhibicias polimerigon, estas uzata kiel herbicido pro sia malalta tokseco por bestaj ĉeloj24. Kontraste al disopiramido, rilataj benzamidoj havas malsamajn celspecifecon. Aldone al plantaj mikrotubuloj, RH-4032 aŭ benzoksamido ankaŭ inhibicias mikrotubulojn de bestaj ĉeloj aŭ oomicetoj, respektive, kaj zalilamido estas uzata kiel fungicido pro sia malalta fitotokseco25,26,27. La nove malkovrita urso kaj ĝiaj derivaĵoj montras selektivan citotoksecon kontraŭ plantoj, sed indas rimarki, ke pliaj modifoj povas ŝanĝi ilian celspecifecon, eble provizante pliajn derivaĵojn por la kontrolo de patogenaj fungoj aŭ oomicetoj.
La unikaj ecoj de urbenonata acido kaj ĝiaj derivaĵoj estas utilaj por ilia disvolviĝo kiel herbicidoj kaj uzo kiel esploriloj. La graveco de la citoskeleto en la kontrolado de la formo de plantĉeloj estas vaste agnoskita. Pli fruaj studoj montris, ke plantoj evoluigis kompleksajn mekanismojn de korteksa mikrotubula organizado per kontrolado de mikrotubula dinamiko por konvene kontroli morfogenezon. Granda nombro da molekuloj respondecaj pri la reguligo de mikrotubula aktiveco estis identigitaj, kaj rilata esplorado ankoraŭ daŭras3,4,28. Nia nuna kompreno pri mikrotubula dinamiko en plantĉeloj ne plene klarigas la mekanismojn de korteksa mikrotubula organizado. Ekzemple, kvankam kaj disopiramido kaj orizalino povas depolimerizi mikrotubulojn, disopiramido kaŭzas severan radikan misprezenton, dum orizalino havas relative mildan efikon. Krome, mutacioj en tubulino, kiu stabiligas mikrotubulojn, ankaŭ kaŭzas dekstrorotacion en radikoj, dum paklitakselo, kiu ankaŭ stabiligas mikrotubulan dinamikon, ne faras tion. Tial, studi kaj identigi la molekulajn celojn de ursola acido devus provizi novajn komprenojn pri la reguligo de plantkortikaj mikrotubuloj. Simile, estontaj komparoj de kemiaĵoj, kiuj efikas en antaŭenigado de distordita kresko, kiel ekzemple disopiramido, kaj malpli efikaj kemiaĵoj, kiel ekzemple orizalino aŭ kumamotora acido, donos indicojn pri kiel okazas distordita kresko.
Aliflanke, defend-rilataj citoskeletaj rearanĝoj estas alia ebleco klarigi la citotoksecon de ursona acido. Infekto de patogeno aŭ enkonduko de elicitoro en plantĉelojn foje kaŭzas detruon de la citoskeleto kaj postan ĉelmorton29. Ekzemple, oomicet-derivita kriptoksantino laŭdire interrompas mikrotubulojn kaj aktinajn filamentojn antaŭ la tabakĉela morto, simile al tio, kio okazas kun KAND-traktado30,31. La similecoj inter defendrespondoj kaj ĉelaj respondoj induktitaj de ursona acido igis nin hipotezi, ke ili ekigas komunajn ĉelajn procezojn, kvankam pli rapida kaj pli forta efiko de ursona acido ol kriptoksantino estas evidenta. Tamen, studoj montris, ke interrompo de aktinaj filamentoj antaŭenigas spontanean ĉelmorton, kiu ne ĉiam estas akompanata de mikrotubula interrompo29. Krome, restas vidi, ĉu aŭ la patogeno aŭ elicitoro kaŭzas distorditan radikkreskon, kiel faras ursonacidaj derivaĵoj. Tiel, molekula scio liganta defendrespondojn kaj la citoskeleton estas alloga problemo por trakti. Per ekspluatado de la ĉeesto de malalt-molekulaj komponaĵoj rilataj al ursona acido, same kiel gamo da derivaĵoj kun ŝanĝiĝantaj potencoj, ili povus provizi ŝancojn celi nekonatajn ĉelajn mekanismojn.
Entute, la malkovro kaj apliko de novaj kombinaĵoj, kiuj modulas la dinamikon de mikrotubuloj, provizos potencajn metodojn por trakti la kompleksajn molekulajn mekanismojn subestantajn la determinadon de la formo de plantĉeloj. En ĉi tiu kunteksto, la ĵus evoluigita kombinaĵo urmotona acido, kiu influas mikrotubulojn kaj aktinajn filamentojn kaj induktas ĉelmorton, povus provizi ŝancon deĉifri la ligon inter la kontrolo de mikrotubuloj kaj ĉi tiuj aliaj mekanismoj. Tiel, kemia kaj biologia analizo uzante urbenonan acidon helpos nin kompreni la molekulajn reguligajn mekanismojn, kiuj kontrolas la citoskeleton de la plantoj.
Inokulu S. werraensis MK493-CF1 en 500 mL kun ŝirmilo en Erlenmeyer-flakono enhavanta 110 mL da semmedio konsistanta el 2% (p/v) galaktozo, 2% (p/v) esenca pasto, 1% (p/v) Bacto-konsisto. -sojtono (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (p/v) maiza ekstrakto (KOGOSTCH Co., Ltd., Japanio), 0.2% (p/v) (NH4)2SO4 kaj 0.2% CaCO3 en dejonigita akvo. (pH 7.4 antaŭ steriligo). La semkulturoj estis kovitaj sur rotacia skuujo (180 rpm) je 27°C dum 2 tagoj. Produktada kultivado per solidstata fermentado. La semkulturo (7 ml) estis translokigita en 500 ml K-1-flakonon enhavantan 40 g da produktadmedio konsistanta el 15 g da premita hordeo (MUSO Co., Ltd., Japanio) kaj 25 g da dejonigita akvo (pH ne ĝustigita antaŭ steriligo). La fermentado estis efektivigita je 30 °C en mallumo dum 14 tagoj. La fermenta materialo estis ekstraktita per 40 ml/botelo da EtOH kaj centrifugita (1500 g, 4 °C, 10 min). La kultursupernatanto (60 ml) estis ekstraktita per miksaĵo de 10% MeOH/EtOAc. La organika tavolo estis vaporigita sub reduktita premo por akiri restaĵon (59.5 mg), kiu estis submetita al HPLC kun gradienta eluado (0–10 minutoj: 90%) sur inversfaza kolono (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × longo 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutoj: 90% H2O/CH3CN ĝis 70% H2O/CH3CN (gradiento), 35–45 minutoj: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutoj: 90% H2O/EtOH ĝis 100% EtOH (gradiento (gradiento), 155–200 min: 100% EtOH) je flukvanto de 1.5 ml/min, kumamonamido (1, 36.0 mg) estis izolita kiel blanka amorfa pulvoro.
Kumamotoamido(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ kalkulita valoro: 141,0659, mezurita valoro: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Kolumbia semoj (Col-0) estis akiritaj de la Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) kun permeso por esplora uzo. Col-0 semoj estis disvastigitaj kaj konservitaj sub niaj laboratoriokondiĉoj kaj uzitaj kiel sovaĝtipaj Arabidopsis-plantoj. Arabidopsis-semoj estis surfac-steriligitaj kaj kultivitaj en duonforta Murashige kaj Skoog-medio enhavanta 2% sakarozon (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (p/v) 2-(4-morfolino)etansulfonatan acidon (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) kaj 1.5% agaragaron (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, je 23 °C kaj konstanta lumo. Semojn de la phs1-1-mutanto provizis T. Hashimoto (Nara Instituto de Scienco kaj Teknologio).
Semojn de la trostreĉiĝo SR-1 provizis T. Hashimoto (Nara Instituto de Scienco kaj Teknologio) kaj uzis ilin kiel sovaĝtipajn tabakplantojn. Tabaksemoj estis surfacsteriligitaj kaj trempitaj en sterila akvo dum tri noktoj por antaŭenigi ĝermadon, poste metitaj en duonfortan solvaĵon enhavantan 2% sakarozon, 0.05% (p/v) MES, kaj 0.8% gellan gumon (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. kaj Skoog medio) kun pH 5.7 kaj inkubaciitaj je 23°C sub konstanta lumo.
Trostreĉiĝo Tak-1 estis provizita de T. Kohchi (Universitato de Kioto) kaj estis uzata kiel la norma eksperimenta unuo por la studo pri hepatikoj. Gemma estis akirita el steriligitaj kultivitaj plantoj kaj poste plantita sur Gamborg B5-medio (Fujifilm Wako Pure Chemical) enhavanta 1% da sakarozo kaj 0.3% da gellan-gumo kaj inkubaciita je 23°C sub kontinua lumo.
Tabakaj BY-2 ĉeloj (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) estis provizitaj de S. Hasezawa (Universitato de Tokio). BY-2 ĉeloj estis diluitaj 95-oble en modifita Linsmeier kaj Skoog medio kaj suplementitaj ĉiusemajne per 2,4-diklorofenoksiacetata acido 32. La ĉelsuspendo estis miksita sur rotacia skuilo je 130 rpm je 27°C en mallumo. Lavu la ĉelojn per 10-obla volumeno de freŝa medio kaj resuspendu en la sama medio. BY-2 transgenaj ĉellinioj stabile esprimantaj la mikrotubulan markilon TagRFP-TUA6 aŭ la aktinan filamentan markilon GFP-ABD2 sub la florbrasika mozaika viruso 35S promotoro estis generitaj kiel priskribite33,34,35. Ĉi tiuj ĉellinioj povas esti konservitaj kaj sinkronigitaj uzante procedurojn similajn al tiuj uzitaj por la originala BY-2 ĉellinio.
HeLa-ĉeloj estis kultivitaj en Dulbecco-modifita Eagle-medio (DMEM) (Life Technologies) suplementita per 10% feta bova serumo, 1.2 U/ml penicilino, kaj 1.2 μg/ml streptomicino en 37°C inkubatoro kun 5% CO2.
Ĉiuj eksperimentoj priskribitaj en ĉi tiu manuskripto estis faritaj laŭ japanaj biosekurecaj regularoj kaj gvidlinioj.
La komponaĵoj estis solvitaj en dimetilsulfoksido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kiel bazaj solvaĵoj kaj diluitaj en MS-medio por Arabidopso kaj tabako aŭ Gamborg B5-medio por hepatiko. Por la radikkreska inhibicia provo, pli ol 10 semoj po plato estis semitaj sur agaragarmedio enhavanta la indikitajn komponaĵojn aŭ DMSO. Semoj estis inkubaciitaj en kreskokamero dum 7 tagoj. La plantidoj estis fotitaj kaj la longo de la radikoj estis mezurita. Por Arabidopsis-ĝermada provo, 48 semoj po plato estis semitaj sur agaragarmedio enhavanta 200 μM da komponaĵo aŭ DMSO. Arabidopsis-semoj estis kultivitaj en kreskokamero kaj la nombro de ĝermitaj plantidoj estis kalkulita 7 tagojn post ĝermado (tag). Por tabaka ĝermada provo, 24 semoj po plato estis semitaj sur agaragarmedio enhavanta 200 μM da KAND aŭ DMSO. Tabaksemoj estis kultivitaj en kreskokamero kaj la nombro de ĝermitaj plantidoj estis kalkulita post 14 tagoj. Por la analizo de inhibicio de kresko de hepatikoj, 9 embrioj de ĉiu plato estis tegitaj sur agaragarmedio enhavanta la indikitajn koncentriĝojn de KAND aŭ DMSO kaj inkubaciitaj en kreskokamero dum 14 tagoj.
Uzu plantidojn makulitajn per 5 mg/ml propidium jodido (PI) por bildigi la organizon de radikaj meristemoj. PI-signaloj estis observitaj per fluoreska mikroskopio uzante TCS SPE konfokusan laseran skanan mikroskopon (Leica Microsystems).
Histokemia tinkturado de radikoj per β-glukuronidazo (GUS) estis farita laŭ la protokolo priskribita de Malami kaj Benfey36. Plantidoj estis fiksitaj en 90% acetono dumnokte, tinkturitaj per 0.5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukurona acido en GUS-bufro dum 1 horo kaj metitaj en hidratigitan kloraldehidan solvaĵon (8 g klora hidrato, 2 ml akvo kaj 1 ml glicerolo) kaj observitaj per diferenciala interferkontrasta mikroskopio uzante Axio Imager M1 mikroskopon (Carl Zeiss).
Radikaj anguloj estis mezuritaj sur 7-tagaj plantidoj kreskigitaj sur vertikale metitaj platoj. Mezuru la angulon de la radiko rilate al la direkto de la gravita vektoro kiel priskribite en paŝo 6.
La aranĝo de kortikaj mikrotubuloj estis observita kiel priskribite, kun negravaj modifoj al la protokolo 37. Kontraŭ-β-tubulina antikorpo (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) kaj Alexa Fluor 488-konjugita kontraŭ-musa IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) estis uzitaj kiel primaraj kaj sekundaraj antikorpoj je diluoj de 1:1000 kaj 1:100, respektive. Fluoreskaj bildoj estis akiritaj per konfokusa lasera skana mikroskopo TCS SPE (Leica Microsystems). Akiru Z-stakajn bildojn kaj kreu projekciojn de maksimuma intenseco laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.
HeLa ĉelmultobliĝanalizo estis farita uzante Cell Counting Kit 8 (Dojindo) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.
La kresko de E. coli DH5α estis analizita per mezurado de ĉeldenseco en kulturo uzante spektrofotometron je 600 nm (OD600).
Ĉelskeleta organizado en transgenaj BY-2-ĉeloj estis observita uzante fluoreskan mikroskopon ekipitan per konfokusa skana aparato CSU-X1 (Yokogawa) kaj sCMOS-fotilo (Zyla, Andor Technology). Ĉelskeleta denseco estis taksita per bildanalizo, kiu kvantigis la procenton de ĉelskeletaj pikseloj inter citoplasmaj pikseloj en konfokusaj bildoj uzante ImageJ-programaron kiel priskribite38,39.
Por detekti ĉelmorton en BY-2-ĉeloj, parto de la ĉelsuspendo estis inkubaciita kun 0.05% Evans-bluo dum 10 minutoj je ĉambra temperaturo. Selektiva Evans-blua kolorigo de mortaj ĉeloj dependas de la eltrudado de la tinkturo el vivkapablaj ĉeloj per la sendifekta plasmomembrano40. Makulitaj ĉeloj estis observitaj per helkampa mikroskopo (BX53, Olympus).
HeLa-ĉeloj estis kreskigitaj en DMEM suplementita per 10% FBS en humidigita inkubatoro je 37°C kaj 5% CO2. Ĉeloj estis traktitaj per 100 μM KAND 11, kumamonama acido 6, kumamonamido 1, 100 ng/ml kolcemido (Gibco), aŭ 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) dum 6 horoj je 37°C. Ĉeloj estis fiksitaj per MetOH dum 10 minutoj kaj poste per acetato dum 5 minutoj je ĉambra temperaturo. Fiksitaj ĉeloj estis inkubaciitaj kun β-tubulina primara antikorpo (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluita en 0.5% BSA/PBS dum 2 horoj, lavitaj 3 fojojn per TBST, kaj poste inkubaciitaj kun Alexa Fluor-kapra antikorpo. 488 1 horo. – Musa IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) kaj 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluita en 0.5% BSA/PBS. Post lavado per TBST trifoje, makulitaj ĉeloj estis observitaj per inversa mikroskopo Nikon Eclipse Ti-E. Bildoj estis kaptitaj per malvarmigita Hamamatsu ORCA-R2 CCD-fotilo uzante MetaMorph-programaron (Molecular Devices).
Afiŝtempo: 17-a de junio 2024