Dankon pro vizito de Nature.com.La versio de retumilo, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por plej bonaj rezultoj, ni rekomendas, ke vi uzu pli novan version de via retumilo (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stilo aŭ JavaScript.
La malkovro kaj utila uzo de naturaj produktoj povas helpi plibonigi homan vivon.Plantkreskaj inhibiciaj kemiaĵoj estas vaste uzataj kiel herbicidoj por kontroli fiherbojn.Pro la bezono uzi malsamajn specojn de herbicidoj, estas bezono identigi kunmetaĵojn kun novaj mekanismoj de ago.En ĉi tiu studo, ni malkovris novan N-alkoxypyrrole-kunmetaĵon, kumamonamidon, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 kaj establis la kompletan sintezan procezon.Per biologiaj agadtestoj, ni malkovris, ke urs-monoamika acido estas sinteza intermediato de urs-monoamido kaj potencialo.inhibitoro de plantokresko.Krome, ni evoluigis diversajn urbenonan acidderivaĵojn, inkluzive de la urbeniloksi-derivaĵo (UDA), kiu havas altan herbidan agadon sen negative influi la kreskon de HeLa-ĉeloj.Ni ankaŭ trovis, ke urmotonaj acidaj derivaĵoj interrompas plantajn mikrotubulojn;krome, KAND influas aktinajn filamentojn kaj induktas ĉelmorton;Tiuj multfacetaj efikoj devias de tiuj de konataj mikrotubelinhibitoroj kaj sugestas novan mekanismon de ago por ursona acido, kiu reprezentas gravan avantaĝon en la evoluo de novaj herbicidoj.
La malkovro kaj praktika apliko de utilaj naturaj produktoj kaj iliaj derivaĵoj estas rimedo por plibonigi la kvaliton de homa vivo.Sekundaraj metabolitoj produktitaj de mikroorganismoj, plantoj kaj insektoj kaŭzis gravajn progresojn en medicino kaj agrikulturo.Multaj antibiotikoj kaj kontraŭleŭkemiaj drogoj estis evoluigitaj el naturaj produktoj.Krome, diversaj specoj depesticidoj, fungicidoj kaj herbicidoj estas ĉerpitaj el tiuj naturaj produktoj por uzo en agrikulturo.Aparte, herbicidaj herbidoj estas gravaj iloj por pliigi kultivaĵojn en moderna agrikulturo, kaj diversaj specoj de kunmetaĵoj jam estas uzataj komerce.Pluraj ĉelaj procezoj en plantoj, kiel ekzemple fotosintezo, aminoacida metabolo, ĉelmura sintezo, reguligo de mitozo, fitohormona signalado, aŭ proteinsintezo, estas konsideritaj tipaj celoj de herbicidoj.Kunmetaĵoj kiuj malhelpas mikrotubulfunkcion estas ofta klaso de herbicidoj kiuj influas plantkreskon influante mitotan reguligon2.
Mikrotubetoj estas komponentoj de la citoskeleto kaj estas vaste konservitaj en eŭkariotaj ĉeloj.La tubulinheterodimero konsistas el α-tubulin kaj β-tubulin formantaj liniajn mikrotubulprotofilamentojn, kie 13 protofilamentoj formas cilindran strukturon.Mikrotubetoj ludas multoblajn rolojn en plantĉeloj, inkluzive de determinado de ĉelformo, ĉeldividiĝo kaj intraĉela transporto3,4.Plantĉeloj enhavas mikrotubulojn sub la interfaza plasmomembrano, kaj tiuj tielnomitaj kortikalaj mikrotubetoj supozeble kontrolas la organizon de celulozomikrofibriloj tra la reguligo de celulozosintezaj kompleksoj4,5.Kortikalaj mikrotubetoj de radikaj epidermaj ĉeloj, ĉeestantaj en la zono de rapida plilongiĝo de la radikpinto, situas flanke, kaj celulozaj mikrofibroj sekvas tiujn mikrotubojn kaj limigas la direkton de ĉela ekspansio, tiel antaŭenigante anizotropan ĉellongiĝon.Tial, mikrotubulfunkcio estas proksime rilatita al plantmorfologio.Anstataŭiĝoj de aminoacidoj en genoj kodantaj tubulin kaŭzas misformiĝon de kortikalaj mikrotubulaj aroj kaj maldekstra- aŭ dekstraflanka kresko en Arabidopsis 6,7.Simile, mutacioj en mikrotubul-rilataj proteinoj kiuj reguligas mikrotubuldinamikon ankaŭ povas konduki al distordita radikkresko8,9,10,11,12,13.Krome, traktado kun mikrotubul-interrompaj herbicidoj kiel disopiramido, ankaŭ konata kiel pretilakloro, ankaŭ kaŭzas maldekstran oblikvan radikkreskon14.Tiuj datenoj indikas ke preciza reguligo de mikrotubulfunkcio estas kritika por determinado de la direkto de plantkresko.
Oni malkovris diversajn specojn de mikrotubelinhibitoroj, kaj ĉi tiuj medikamentoj faris signifajn kontribuojn al citoskeleta esplorado, same kiel al agrikulturo kaj medicino2.Aparte, orizalino, dinitroanilin-kunmetaĵoj, disopiramido, benzamid-rilataj kunmetaĵoj, kaj iliaj analogaĵoj povas malhelpi mikrotubulfunkcion kaj tiel malhelpi plantkreskon.Tial ili estas vaste uzataj kiel herbicidoj.Tamen, ĉar mikrotubetoj estas grava komponento de planto- kaj bestaj ĉeloj, la plej multaj mikrotubelinhibitoroj estas citotoksaj al ambaŭ ĉeltipoj.Tial, malgraŭ ilia agnoskita utileco kiel herbicidoj, limigita nombro da kontraŭmikrotubulaj agentoj estas uzataj por praktikaj celoj.
Streptomyces estas genro de la familio Streptomyces, kiu inkludas aerobiajn, gram-pozitivajn, filamentajn bakteriojn kaj estas vaste konata pro sia kapablo produkti larĝan gamon de sekundaraj metabolitoj.Tial ĝi estas konsiderata unu el la plej gravaj fontoj de novaj biologie aktivaj naturaj produktoj.En la nuna studo, ni malkovris novan kunmetaĵon nomitan kumamonamido, kiu estis izolita de Streptomyces werraensis MK493-CF1 kaj S. werraensis ISP 5486. Uzante spektran analizon kaj plenan spektran analizon, la strukturo de kumamonamido estis karakterizita kaj ĝia unika N-alkoksipirrola skeleto. estis determinita.sintezo.Ursmona acido, sinteza intermediato de ursmonoamido kaj ĝiaj derivaĵoj, estis trovita malhelpi la kreskon kaj ĝermadon de la populara modelplanto Arabidopsis thaliana.En studo-rilata strukturo-aktiveco, ni trovis, ke kunmetaĵo kun C9 modifita al ursona acido, nomata nonyloxy derivaĵo de ursona acido (KAND), signife plibonigas la inhibician efikon sur kresko kaj ĝermado.Precipe, la lastatempe malkovrita plantkreskinhibitoro ankaŭ influis la kreskon de tabako kaj hepato kaj ne estis citotoksa al bakterioj aŭ HeLa-ĉeloj.Krome, kelkaj urmotonaj acidderivaĵoj induktas distorditan radikfenotipon, implicante ke tiuj derivaĵoj rekte aŭ nerekte influas mikrotubulojn.Konsekvence kun ĉi tiu ideo, niaj observoj de mikrotubetoj etikeditaj aŭ imunohistokemie aŭ kun fluoreskaj proteinoj indikas ke KAND-traktado malpolimerigas mikrotubulojn.Krome, traktado kun kumamotonacidaj derivaĵoj interrompis aktinajn mikrofilamentojn.Tiel, ni malkovris novan plantkreskan inhibitoron, kies unika mekanismo de ago implikas detruon de la citoskeleto.
Trostreĉiĝo MK493-CF1 estis izolita de grundo en Shinagawa-ku, Tokio.Trostreĉiĝo MK493-CF1 formis bone branĉitan stroman micelion.La parta sekvenco de la 16S ribosoma RNA-geno (1422 bp) estis determinita.Tiu trostreĉiĝo estas tre simila al S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipa trostreĉiĝo, 99.93%).Surbaze de tiu rezulto, estis determinite ke tiu trostreĉiĝo estis proksime rilatita al la tiptrostreĉiĝo de S. werraensis.Tial, ni provizore nomis ĉi tiun trostreĉiĝon S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T ankaŭ produktas la samajn bioaktivajn kunmetaĵojn.Ĉar ekzistis malmulte da frua esplorado en akirado de naturproduktoj de tiu mikroorganismo, plia kemia esplorado estis aranĝita.Post kultivado de S. werraensis MK493-CF1 sur hordea medio per solidsubstanca fermentado je 30 °C dum 14 tagoj, la medio estis ĉerpita kun 50% EtOH.60 ml da specimeno estis sekigitaj por akiri 59,5 mg da kruda ekstrakto.La kruda ekstrakto estis submetita al inversa fazo HPLC por doni N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, nomita cumamonamide, 36.0 mg).La totala kvanto de 1 estas proksimume 60% de la kruda ekstrakto.Tial ni decidis detale studi la ecojn de kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 estas blanka amorfa pulvoro kaj alta rezolucia mas-spektrometrio (HRESIMS) konfirmas C6H8N2O2 (Fig. 1).La C2-anstataŭigita pirolfragmento de tiu kunmetaĵo estas karakterizita per δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH en 1H NMR-spektro: 4.5 Hz , H-5) kaj δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), kaj la 13C NMR-spektro montras la ĉeeston de kvar sp2 karbonatomoj.La ĉeesto de amidgrupo ĉe la C2-pozicio estis taksita per HMBC-korelacio de la C-3-protono ĝis la amida karbonilkarbono ĉe δC 161.1.Krome, 1 H kaj 13 C NMR pintoj ĉe δH 4.10 (3H, S) kaj δC 68.3 indikas la ĉeeston de N-metoksigrupoj en la molekulo.Kvankam la ĝusta pozicio de la metoksigrupo ankoraŭ ne estis determinita uzante spektroskopan analizon kiel ekzemple plifortigita diferencspektroskopio kaj nuklea Overhauser-mallongigo (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide iĝis la unua kandidatkunmetaĵo.
Por determini la ĝustan strukturon de 1, tuta sintezo estis farita (Fig. 2a).Traktado de komerce havebla 2-aminopiridino 2 kun m-CPBA rezultigis la respondan N-oksidon 3 en kvanta rendimento.Post la 2-aminoazidado de 2, la ciklokondensiga reago priskribita de Abramovich estis efektivigita en benzeno je 90 °C por akiri la deziratan 1-hidroksi-1H-pirrol-2-karbonitrilon 5 en gramoj.Rapido 60% (du stadioj).15,16.Metilado kaj hidrolizo de 4 tiam donis 1-metoksi-1H-pirole-2-karboksilian acidon (nomitan "kumotonan acidon", 6) en bona rendimento (70%, du paŝoj).Finfine, amidado per acida klorida intermediato 6 uzanta akvan amoniako donis Kumamoto-amidon 1 en 98%-rendimento.Ĉiuj spektraj datumoj de sintezita 1 estis similaj al izolita 1, do la strukturo de 1 estis determinita;
Ĝenerala sintezo kaj analizo de la biologia agado de urbenamido kaj urbenacido.(a) Totala sintezo de Kumamoto-amido.(b) Septagaj sovaĝaj plantidoj de Arabidopsis Columbia (Col) estis kultivitaj sur Murashige kaj Skoog (MS) teleroj enhavantaj kumamonamidon 6 aŭ kumamonamidon 1 ĉe la indikitaj koncentriĝoj.Skalstango = 1 cm.
Unue, ni taksis la biologiajn agadojn de urbenamido kaj ĝiaj intermetoj por ilia kapablo moduli plantkreskon.Ni aldonis diversajn koncentriĝojn de ursmonamide 1 aŭ ursmona acido 6 al MS-agar-medio kaj kulturitajn plantidojn de Arabidopsis thaliana sur ĉi tiu medio.Ĉi tiuj provoj montris, ke altaj koncentriĝoj (500 μM) de 6 malhelpis radikan kreskon (Fig. 2b).Poste, ni generis diversajn derivaĵojn anstataŭigante la N1-pozicion de 6 kaj faris studojn pri strukturo-aktiveco pri ili (la analoga sinteza procezo estas priskribita en la Subtenaj Informoj (SI)).Arabidopsis-plantidoj estis kultivitaj sur medio enhavanta 50 μM ursonacidajn derivaĵojn, kaj radiklongo estis mezurita.kiel ĝi montras sur la bildo.Kiel montrite en figuroj 3a, b, kaj S1, kumacidoj havas malsamajn longojn de liniaj alkoksiĉenoj (9, 10, 11, 12, kaj 13) aŭ grandajn alkoksikatenojn (15, 16, kaj 17) ĉe la N1-pozicio.La derivaĵoj montris signifan inhibicion de radikkresko.Krome, ni trovis, ke apliko de 200 μM 10, 11, aŭ 17 malhelpis ĝermadon (Fig. 3c kaj S2).
Studo de la strukturo-aktiveca rilato de Kumamoto-amido kaj rilataj kunmetaĵoj.(a) Strukturo kaj sinteza skemo de analogoj.(b) Kvantigo de radiklongo de 7-tagaj plantidoj kreskigitaj sur MS-medio kun aŭ sen 50 μM kumamonamide-derivaĵoj.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn kun falsa traktado (t-testo, p< 0,05).n>18. Datumoj estas montritaj kiel meznombro ± SD.nt signifas "ne provita" ĉar pli ol 50% de la semoj ne ĝermis.(c) Kvantigo de ĝerma indico de traktitaj semoj kovataj dum 7 tagoj en MS-medio kun aŭ sen 200 μM kumamonamido kaj rilataj kunmetaĵoj.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn kun falsa traktado (ĉi-kvadrata testo).n=96.
Interese, la aldono de alkilflankĉenoj pli longaj ol C9 reduktis la inhibician agadon, sugestante ke kumamotoic-acido-rilataj kunmetaĵoj postulas flankĉenojn de certa grandeco elmontri sian biologian agadon.
Ĉar struktur-aktiveca rilatanalizo montris, ke C9 estis modifita al ursona acido kaj la noniloksia derivaĵo de ursona acido (ĉi-poste nomata KAND 11) estis la plej efika plantkreskinhibitoro, ni faris pli detalan karakterizadon de KAND 11. Traktado de Arabidopsis kun 50 μM KAND 11 preskaŭ tute malhelpis ĝermadon, dum pli malaltaj koncentriĝoj (40, 30, 20, aŭ 10 μM) de KAND 11 malhelpis radikkreskon en dozo-dependa maniero (Fig. 4a, b).Por testi ĉu KAND 11 influas radikmeristeman daŭrigeblecon, ni ekzamenis radikmeristemojn makulitajn kun propidiojoduro (PI) kaj mezuris meristeman areon.La grandeco de la meristemo de plantidoj kreskigitaj sur medio enhavanta 25 μM KAND-11 estis 151.1 ± 32.5 μm, dum la grandeco de la meristemo de plantidoj kreskigitaj sur kontrolmedio enhavanta DMSO estis 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d) , kiu indikas ke KAND-11 restarigas ĉelan agadon.disvastiĝanta.Radika meristemo.Konsekvence kun ĉi tio, KAND 11-traktado reduktis la kvanton de ĉeldivida markilo CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signalo en la radika meristemo (Fig. 4e) 17 .Tiuj rezultoj indikas ke KAND 11 malhelpas radikkreskon reduktante ĉelan proliferadaktivecon.
Analizo de la inhibicia efiko de urbenonacidaj derivaĵoj (urbeniloksiderivaĵoj) sur kresko.(a) 7-tagaj sovaĝ-specaj Col-plantidoj kreskigitaj sur MS-platoj kun la indikitaj koncentriĝoj de KAND 11. Skalstango = 1 cm.(b) Kvantigo de radiklongo.Literoj indikas signifajn diferencojn (Tukey HSD-testo, p< 0,05).n>16. Datumoj estas montritaj kiel meznombro ± SD.(c) Konfoka mikroskopio de propidio-jodid-makulaj sovaĝtipaj Col-radikoj kreskigitaj sur MS-platoj kun aŭ sen 25 μM KAND 11. Blankaj krampoj indikas radikmeristemon.Skalstango = 100 µm.(d) Kvantigo de radika meristema grandeco (n = 10 ĝis 11).Statistikaj diferencoj estis determinitaj per t-testo (p< 0,05).La stangoj reprezentas la mezan meristeman grandecon.(e) Diferenciga interferkontrasto (DIC) mikroskopio de radika meristemo enhavanta la CDKB2-konstruaĵon;1pro: CDKB2;1-GUS makulita kaj makulita sur 5-tagaj plantidoj kreskigitaj sur MS-platoj kun aŭ sen 25 µM KAND-analizo.
La fitotokseco de KAND 11 estis plue testita uzante alian dukotiledonan planton, tabakon ( Nicotiana tabacum ), kaj gravan terplantan modelorganismon, hepaton (Marchantia polymorpha).Kiel en la kazo de Arabidopsis, tabakaj SR-1-plantidoj kreskitaj sur medio enhavanta 25 μM KAND 11 produktis pli mallongajn radikojn (Fig. 5a).Plie, 40 el 48 semoj ĝermis sur teleroj enhavantaj 200 μM KAND 11, dum ĉiuj 48 semoj ĝermis sur mok-traktita amaskomunikilaro, indikante ke pli altaj koncentriĝoj de KAND estis signifaj (p.< 0,05;chi-testo -kvadrato) malhelpis la ĝermadon de tabako.(Fig. 5b).Krome, la koncentriĝo de KAND 11, kiu malhelpis bakterian kreskon en hepato, estis simila al la efika koncentriĝo en Arabidopsis (Fig. 5c).Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke KAND 11 povas malhelpi la kreskon de diversaj plantoj.Ni tiam esploris la eblan citotoksecon de ursaj monoamide-rilataj kunmetaĵoj en aliaj organismoj, nome homaj HeLa-ĉeloj kaj Escherichia coli-trostreĉiĝo DH5α, kiel reprezentantoj de pli altaj bestaj kaj bakteriaj ĉeloj, respektive.En serio de ĉelaj proliferaj provoj, ni observis, ke kumamonamide 1, cumamonamida acido 6 kaj KAND 11 ne influis la kreskon de HeLa aŭ E. coli ĉeloj ĉe koncentriĝoj de 100 μM (Fig. 5d, e).
Kreska inhibicio de KAND 11 en ne-Arabidopsis-organismoj.(a) Dusemajnaj sovaĝaj SR-1 tabakplantidoj estis kultivitaj sur vertikale poziciigitaj MS-platoj enhavantaj 25 μM KAND 11. (b) Dusemajnaj sovaĝ-specaj SR-1-tabakplantidoj estis kultivitaj sur horizontale poziciigitaj. MS-platoj enhavantaj 200 μM KAND 11. (c) Dusemajnaj sovaĝ-specaj Tak-1 hepatoburĝonoj kreskigitaj sur Gamborg B5-platoj kun la indikitaj koncentriĝoj de KAND 11. Ruĝaj sagoj indikas sporojn kiuj ĉesis kreski ene de la du-semajna kovado. periodo.(d) Testo pri proliferado de ĉeloj de HeLa-ĉeloj.La nombro da realigeblaj ĉeloj estis mezurita je fiksaj tempintervaloj uzante ĉelkalkulilon 8 (Dojindo).Kiel kontrolo, HeLa-ĉeloj estis traktitaj kun 5 μg/ml aktinomicino D (Akto D), kiu malhelpas RNA-polimeraztransskribon kaj kaŭzas ĉelmorton.Analizoj estis faritaj triope.(e) E. coli ĉela proliferado provo.E. coli kresko estis analizita per mezurado de OD600.Kiel kontrolo, ĉeloj estis traktitaj kun 50 μg/ml ampicilino (Amp), kiu malhelpas la sintezon de bakteria ĉela muro.Analizoj estis faritaj triope.
Por deĉifri la mekanismon de ago de citotokseco kaŭzita de uramide-rilataj kunmetaĵoj, ni reanalizis urbenacidajn derivaĵojn kun moderaj inhibiciaj efikoj.kiel ĝi montras sur la bildo.Kiel montrite en Figuroj 2b, 6a, plantidoj kreskigitaj sur agarplatoj enhavantaj altajn koncentriĝojn (200 μM) de urmotona acido 6 produktis pli mallongajn kaj maldekstrajn kurbajn radikojn (θ = – 23.7 ± 6.1), dum de plantidoj kreskigitaj sur la kontrolmedio, la plantidoj produktis preskaŭ rektajn radikojn (θ = – 3,8 ± 7,1).Ĉi tiu karakteriza oblikva kresko povas rezulti de misfunkcio de kortikalaj mikrotuboj14,18.Konsekvence kun ĉi tiu trovo, la mikrotubul-malstabiligaj drogoj disopiramido kaj orizalino induktis similan radikkliniĝon sub niaj kreskkondiĉoj (Fig. 2b, 6a).Samtempe, ni testis urmotonan acidderivaĵojn kaj elektis plurajn el ili kiuj, ĉe certaj koncentriĝoj, induktis oblikvan radikkreskon.Kunmetaĵoj 8, 9 kaj 15 ŝanĝis la direkton de radika kresko je 75 μM, 50 μM kaj 40 μM, respektive, indikante, ke ĉi tiuj kunmetaĵoj povas efike malstabiligi mikrotubulojn (Fig. 2b, 6a).Ni ankaŭ testis la plej potencan ursolacidan derivaĵon, KAND 11, ĉe pli malalta koncentriĝo (15 µM) kaj trovis, ke aplikado de KAND 11 malhelpis radikkreskon kaj ke la direkto de radikkresko estis malebena, kvankam ili emis deklivi maldekstren ( Figuro C3)..Ĉar pli altaj koncentriĝoj de mikrotubul-malstabiligaj medikamentoj foje malhelpas plantkreskon prefere ol kaŭzi radikkliniĝon, ni poste taksis la eblecon ke KAND 11 influas mikrotubulojn observante kortikajn mikrotubulojn en radikaj epidermaj ĉeloj.Imunohistokemio uzanta kontraŭ-β-tubulinajn antikorpojn en epidermaj ĉeloj de plantigaj radikoj traktitaj kun 25 μM KAND 11 montris la malaperon de preskaŭ ĉiuj kortikalaj mikrotubetoj en epidermaj ĉeloj en la plilongiga zono (Fig. 6b).Tiuj rezultoj indikas ke kumamotona acido kaj ĝiaj derivaĵoj agas rekte aŭ nerekte sur mikrotubetoj por interrompi ilin kaj ke tiuj kunmetaĵoj estas novaj mikrotubelinhibitoroj.
Ursona acido kaj ĝiaj derivaĵoj ŝanĝas kortikalajn mikrotubulojn en Arabidopsis thaliana.(a) Radika inklinangulo mezurita en ĉeesto de diversaj urmotonaj acidaj derivaĵoj ĉe la indikitaj koncentriĝoj.La efikoj de du kunmetaĵoj konataj inhibicii mikrotubulojn: disopiramido kaj orizalino ankaŭ estis analizitaj.La enmetita montras la normon uzatan por mezuri radikan kreskangulon.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn kun falsa traktado (t-testo, p< 0,05).n>19. Skalstango = 1 cm.(b) Kortikalaj mikrotuboj en epidermaj ĉeloj en la plilongiĝozono.Mikrotubetoj en sovaĝ-tipaj Arabidopsis Col-radikoj kreskigitaj sur MS-platoj kun aŭ sen 25 μM KAND 11 estis bildigitaj per imunohistokemia makulado uzante β-tubulin-primarajn antikorpojn kaj Alexa Fluor-konjugatajn sekundarajn antikorpojn.Skalstango = 10 µm.(c) Mitota strukturo de mikrotubetoj en la radika meristemo.Mikrotuboj estis bildigitaj uzante imunohistokemian makuladon.Mitotaj strukturoj, inkluzive de profazzonoj, spindeloj, kaj fragmoplastoj, estis nombritaj de konfokusaj bildoj.Sagoj indikas mitotajn mikrotubulstrukturojn.Asteriskoj indikas signifajn diferencojn kun falsa traktado (t-testo, p< 0,05).n>9. Skalstango = 50 µm.
Kvankam Ursa havas la kapablon interrompi mikrotubulfunkcion, ĝia mekanismo de ago estas atendita esti diferenca de tipaj mikrotubulaj malpolimerigaj agentoj.Ekzemple, pli altaj koncentriĝoj de mikrotubulaj malpolimerigaj agentoj kiel ekzemple disopiramido kaj orizalino induktas anizotropan vastiĝon de epidermaj ĉeloj, dum KAND 11 ne faras.Krome, kunapliko de KAND 11 kaj disopiramido rezultigis kombinitan disopiramide-induktitan radikan kreskorespondon kaj KAND 11-induktita kresko-inhibicio estis observita (Fig. S4).Ni ankaŭ analizis la respondon de la hipersentema disopiramida 1-1 (phs1-1) mutaciulo al KAND 11. phs1-1 havas ne-kanonan tubulinkinazan punktomutacion kaj produktas pli mallongajn radikojn kiam traktita kun disopiramido9,20.phs1-1 mutaciantaj plantidoj kultivitaj sur agarmedio enhavanta KAND 11 havis pli mallongajn radikojn similajn al tiuj kreskigitaj sur disopiramido (fig. S5).
Krome, ni observis mitotajn mikrotubulajn strukturojn, kiel profazzonojn, spindelojn kaj fragmoplastojn, en la radika meristemo de plantidoj traktitaj kun KAND 11. Konsekvence kun la observoj por CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, signifa malkresko en la nombro da mitotaj mikrotuboj estis observita (Fig. .6c).
Por karakterizi la citotoksecon de KAND 11 ĉe subĉela rezolucio, ni traktis tabakajn BY-2-pendajn ĉelojn kun KAND 11 kaj observis ilian respondon.Ni unue aldonis KAND 11 al BY-2-ĉeloj esprimantaj TagRFP-TUA6, kiu fluoreske etikedas mikrotubulojn, por taksi la efikon de KAND 11 sur kortikalaj mikrotubetoj.Kortikala mikrotubula denseco estis taksita per bildanalizo, kiu kvantigis la procenton de citoskeletaj pikseloj inter citoplasmaj pikseloj.La analizrezultoj montris, ke post traktado kun 50 μM aŭ 100 μM KAND 11 dum 1 horo, la denseco malpliiĝis signife al 0.94 ± 0.74% aŭ 0.23 ± 0.28%, respektive, dum la denseco de ĉeloj traktitaj kun DMSO, sumiĝis al ± 1061. % (Fig. 7a).Ĉi tiuj rezultoj kongruas kun la observo en Arabidopsis, ke KAND 11-traktado induktas malpolimerigon de kortikalaj mikrotuboj (Fig. 6b).Ni ankaŭ ekzamenis la BY-2-linion kun GFP-ABD-etikeditaj aktinaj filamentoj post traktado kun la sama koncentriĝo de KAND 11 kaj observis, ke KAND 11-traktado interrompis la aktinajn filamentojn.Traktado kun 50 μM aŭ 100 μM KAND 11 dum 1 h signife reduktis la densecon de aktina filamento al 1.20 ± 0.62% aŭ 0.61 ± 0.26% respektive, dum la denseco en ĉeloj traktitaj kun DMSO estis 1.69 ± 0.69% (Fig.7b).Ĉi tiuj rezultoj kontrastas kun la efikoj de propizamido, kiu ne influas aktinfilamentojn, kaj latrunculin B, aktina malpolimerizilo kiu ne influas mikrotubulojn (SI Figuro S6).Krome, traktado kun kumamonamida 1, kumamonamida acido 6 aŭ KAND 11 ne influis mikrotubulojn en HeLa-ĉeloj (SI Figuro S7).Tiel, la mekanismo de ago de KAND 11 verŝajne estas diferenca de tiu de konataj citoskeletinterrompantoj.Krome, nia mikroskopa observado de BY-2-ĉeloj traktitaj kun KAND 11 rivelis la komencon de ĉelmorto dum KAND 11-traktado kaj montris, ke la proporcio de Evans blu-makulitaj mortaj ĉeloj ne pliiĝis signife post 30 minutoj de KAND 11-traktado, dum post 90 minutoj da traktado kun 50 μM aŭ 100 μM KAND, la nombro da mortaj ĉeloj pliiĝis al 43.7% aŭ 80.1%, respektive (Fig. 7c).Kune, ĉi tiuj datumoj indikas, ke la nova ursolacida derivaĵo KAND 11 estas plant-specifa citoskeleta inhibitoro kun antaŭe nekonata mekanismo de ago.
KAND influas kortikajn mikrotubulojn, aktinfilamentojn, kaj daŭrigeblecon de tabakĉeloj BY-2.(a) Bildigo de kortikalaj mikrotubetoj en BY-2-ĉeloj en ĉeesto de TagRFP-TUA6.BY-2-ĉeloj traktitaj kun KAND 11 (50 μM aŭ 100 μM) aŭ DMSO estis ekzamenitaj per konfokusa mikroskopio.Kortikala mikrotubuldenseco estis kalkulita de mikrografioj de 25 sendependaj ĉeloj.Literoj indikas signifajn diferencojn (Tukey HSD-testo, p< 0,05).Skalstango = 10 µm.(b) Kortikalaj aktinaj filamentoj en BY-2-ĉeloj bildigitaj en la ĉeesto de GFP-ABD2.BY-2-ĉeloj traktitaj kun KAND 11 (50 μM aŭ 100 μM) aŭ DMSO estis ekzamenitaj per konfokusa mikroskopio.La denseco de kortikalaj aktinfilamentoj estis kalkulita de mikrografioj de 25 sendependaj ĉeloj.Literoj indikas signifajn diferencojn (Tukey HSD-testo, p< 0,05).Skalstango = 10 µm.(c) Observado de mortaj BY-2-ĉeloj per Evans-blua makulo.BY-2-ĉeloj traktitaj kun KAND 11 (50 μM aŭ 100 μM) aŭ DMSO estis ekzamenitaj per lumkampa mikroskopio.n=3.Skalstango = 100 µm.
La eltrovo kaj apliko de novaj naturaj produktoj kaŭzis signifajn progresojn en diversaj aspektoj de homa vivo, inkluzive de medicino kaj agrikulturo.Historiesploro estis farita por akiri utilajn kunmetaĵojn el naturresursoj.Aparte, aktinomicetoj estas konataj kiel utilaj kiel kontraŭparazitaj antibiotikoj por nematodoj pro sia kapablo produkti diversajn sekundarajn metabolitojn kiel ekzemple avermektino, la plumbokunmetaĵo de ivermektino kaj bleomicino kaj ĝiaj derivaĵoj, uzataj medicine kiel kontraŭkancera agento21,22.Same, diversaj herbicidaj kunmetaĵoj estis malkovritaj el aktinomicetoj, kelkaj el kiuj jam estas uzataj komerce1,23.Tial, la analizo de aktinomicetaj metabolitoj por izoli naturajn produktojn kun dezirataj biologiaj agadoj estas konsiderita efika strategio.En ĉi tiu studo, ni malkovris novan kunmetaĵon, kumamonamidon, de S. werraensis kaj sukcese sintezis ĝin.Ursona acido estas sinteza intermediato de urbenamido kaj ĝiaj derivaĵoj.Ĝi povas kaŭzi karakterizan radikbukliĝon, elmontri moderan ĝis fortan herbidan agadon kaj rekte aŭ nerekte damaĝi plantmikrotubojn.Tamen, la mekanismo de ago de urmotona acido povas diferenci de tiu de ekzistantaj mikrotubelinhibitoroj, ĉar KAND 11 ankaŭ interrompas aktinfilamentojn kaj kaŭzas ĉelmorton, sugestante reguligan mekanismon de kiu urmotona acido kaj ĝiaj derivaĵoj influas larĝan gamon de citoskeletaj strukturoj..
Plia detala karakterizado de urbenona acido helpos pli bone kompreni la mekanismon de ago de urbenona acido.Aparte, la venonta celo estas taksi la kapablon de ursona acido ligi al reduktitaj mikrotubetoj por determini ĉu ursona acido kaj ĝiaj derivaĵoj agas rekte sur mikrotubetoj kaj malpolimerigas ilin, aŭ ĉu ilia ago rezultigas mikrotubulmalstabiligon.Krome, en la kazo kie mikrotubetoj ne estas rekta celo, identigi la lokon de ago kaj molekulaj celoj de ursona acido sur plantaj ĉeloj helpos pli kompreni la ecojn de rilataj kunmetaĵoj kaj eblajn manierojn plibonigi herbicidan aktivecon.Nia bioaktiveca analizo malkaŝis la unikan citotoksan kapablon de ursona acido pri la kresko de plantoj kiel Arabidopsis thaliana, tabako kaj hepato, dum nek E. coli nek HeLa-ĉeloj estis tuŝitaj.Malmulta aŭ neniu tokseco al bestaj ĉeloj estas avantaĝo de ursonacidaj derivaĵoj se ili estas evoluigitaj kiel herbicidoj por uzo en malfermaj agrikulturaj kampoj.Efektive, ĉar mikrotubetoj estas oftaj strukturoj en eŭkariotoj, ilia selektema inhibicio en plantoj estas ŝlosila postulo por herbicidoj.Ekzemple, propizamido, mikrotubula malpolimeriga agento kiu rekte ligas al tubulino kaj malhelpas polimerigon, estas uzata kiel herbicido pro sia malalta tokseco al bestaj ĉeloj24.Kontraste al disopiramido, rilataj benzamidoj havas malsamajn celspecifojn.Krom plantaj mikrotubetoj, RH-4032 aŭ benzoxamide ankaŭ malhelpas mikrotubulojn de bestaj ĉeloj aŭ oomicetoj, respektive, kaj zalilamido estas uzata kiel fungicido pro sia malalta fitotokseco25,26,27.La lastatempe malkovrita urso kaj ĝiaj derivaĵoj elmontras selekteman citotoksecon kontraŭ plantoj, sed indas noti ke pliaj modifoj povas ŝanĝi sian celspecifecon, eble disponigante kromajn derivaĵojn por la kontrolo de patogenaj fungoj aŭ oomicetoj.
La unikaj propraĵoj de urbenona acido kaj ĝiaj derivaĵoj estas utilaj por ilia evoluo kiel herbicidoj kaj uzo kiel esploriloj.La graveco de la citoskeleto en kontrolado de plantĉelformo estas vaste rekonita.Pli fruaj studoj montris ke plantoj evoluigis kompleksajn mekanismojn de kortikala mikrotubulorganizo kontrolante mikrotubuldinamikon por konvene kontroli morfogenezon.Granda nombro da molekuloj respondecaj pri la reguligo de mikrotubula aktiveco estis identigita, kaj rilata esplorado daŭre daŭras3,4,28.Nia nuna kompreno de mikrotubuldinamiko en plantĉeloj ne plene klarigas la mekanismojn de kortikala mikrotubula organizo.Ekzemple, kvankam kaj disopiramido kaj orizalino povas malpolimerigi mikrotubulojn, disopiramido kaŭzas severan radikmisprezenton dum orizalino havas relative mildan efikon.Krome, mutacioj en tubulino, kiu stabiligas mikrotubulojn, ankaŭ kaŭzas dekstrorotacion en radikoj, dum paclitaxel, kiu ankaŭ stabiligas mikrotubuldinamikon, ne faras.Tial, studi kaj identigi la molekulajn celojn de ursola acido devus disponigi novajn sciojn pri la reguligo de plantkortikalaj mikrotubetoj.Same, estontaj komparoj de kemiaĵoj kiuj estas efikaj en antaŭenigado de distordita kresko, kiel ekzemple disopiramido, kaj malpli efikaj kemiaĵoj, kiel ekzemple orizalino aŭ kumamotora acido, provizos indicojn al kiom distordita kresko okazas.
Aliflanke, defend-rilataj citoskeletaj rearanĝoj estas alia ebleco klarigi la citotoksecon de ursona acido.Infekto de patogeno aŭ enkonduko de elicitoro en plantĉelojn foje kaŭzas detruon de la citoskeleto kaj postan ĉelmorton29.Ekzemple, oomicet-derivita kriptoksantino estis raportita interrompi mikrotubulojn kaj aktinfilamentojn antaŭ tabakĉelmorto, simile al kio okazas kun KAND-traktado30,31.La similecoj inter defendaj respondoj kaj ĉelaj respondoj induktitaj per ursona acido igis nin hipotezi ke ili ekigas oftajn ĉelajn procezojn, kvankam pli rapida kaj pli forta efiko de ursona acido ol kriptoksantino estas evidenta.Tamen, studoj montris, ke interrompo de aktinaj filamentoj antaŭenigas spontanean ĉelan morton, kiu ne ĉiam estas akompanata de mikrotubula interrompo29.Krome, restas vidi ĉu aŭ la patogeno aŭ elicitor kaŭzas distorditan radikkreskon, kiel faras ursonacidaj derivaĵoj.Tiel, molekula scio liganta defendrespondojn kaj la citoskeleton estas alloga problemo por esti traktita.Ekspluatante la ĉeeston de malaltaj molekulpezaj komponaĵoj ligitaj al ursona acido, same kiel gamon da derivaĵoj kun diversaj potencoj, ili povas disponigi ŝancojn celi nekonatajn ĉelajn mekanismojn.
Kune, la eltrovo kaj apliko de novaj kunmetaĵoj kiuj modulas mikrotubuldinamikon provizos potencajn metodojn por trakti la kompleksajn molekulajn mekanismojn subesta plantĉelformdetermino.En ĉi tiu kunteksto, la lastatempe evoluinta kunmetaĵo urmotona acido, kiu influas mikrotubulojn kaj aktinajn filamentojn kaj induktas ĉelmorton, povas disponigi ŝancon deĉifri la ligon inter mikrotubula kontrolo kaj tiuj aliaj mekanismoj.Tiel, kemia kaj biologia analizo uzanta urbenonan acidon helpos nin kompreni la molekulajn reguligajn mekanismojn kiuj kontrolas la plantan citoskeleton.
Inokuli S. werraensis MK493-CF1 en 500 mL konfuzitan Erlenmeyer-flakon enhavanta 110 mL da semmedio konsistanta el 2% (w/v) galaktozo, 2% (w/v) Esenca pasto, 1% (w/v) Bacto-konsisto. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) maiza ekstrakto (KOGOSTCH Co., Ltd., Japanio), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 kaj 0.2% CaCO3 en dejonigita akvo.(pH 7.4 antaŭ steriligo).La semkulturoj estis kovataj sur rotacia skuilo (180 rpm) je 27 °C dum 2 tagoj.Produkta kultivado per solidstata fermentado.La semokulturo (7 ml) estis transdonita en 500 ml K-1-flakon enhavanta 40 g da produktmedio konsistanta el 15 g da premita hordeo (MUSO Co., Ltd., Japanio) kaj 25 g da dejonigita akvo (pH ne alĝustigita). antaŭ steriligo).).Fermentado estis farita je 30 °C en la mallumo dum 14 tagoj.La fermentada materialo estis ĉerpita per 40 ml/botelo EtOH kaj centrifugata (1500 g, 4 °C, 10 min).La kultura supernatant (60 ml) estis ĉerpita kun miksaĵo de 10% MeOH/EtOAc.La organika tavolo estis vaporigita sub reduktita premo por akiri restaĵon (59.5 mg), kiu estis submetita al HPLC kun gradienta elucio (0-10 minutoj: 90%) sur inversfaza kolono (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × longo 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutoj: 90% H2O/CH3CN ĝis 70% H2O/CH3CN (gradiento), 35–45 minutoj: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutoj: 90% H2O /EtOH al 100% EtOH (gradiento (gradiento), 155–200 min: 100% EtOH) kun flukvanto de 1.5 ml/min, kumamonamido (1, 36.0 mg) estis izolita kiel blanka amorfa pulvoro.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ kalkulita valoro: 141.0659, mezurita valoro: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.537
Columbia-semoj (Col-0) estis akiritaj de la Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) kun permeso por esploruzo.Col-0-semoj estis disvastigitaj kaj konservitaj sub niaj laboratoriokondiĉoj kaj uzataj kiel sovaĝaj Arabidopsis plantoj.Arabidopsis-semoj estis surfacaj steriligitaj kaj kultivitaj en duonforta Murashige kaj Skoog medio enhavanta 2% sakarozon (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morfolino) etansulfona acido (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) kaj 1.5% agaro (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, je 23 °C kaj konstanta lumo.Semoj de la phs1-1 mutaciulo estis disponigitaj fare de T. Hashimoto (Nara Instituto de Scienco kaj Teknologio).
Semoj de trostreĉiĝo SR-1 estis disponigitaj fare de T. Hashimoto (Nara Instituto de Scienco kaj Teknologio) kaj utiligitaj kiel sovaĝ-specaj tabakplantoj.Tabaksemoj estis surfacaj steriligitaj kaj trempitaj en sterila akvo dum tri noktoj por antaŭenigi ĝermadon, tiam metitaj en duon-fortan solvaĵon enhavanta 2% sakarozon, 0.05% (w/v) MES, kaj 0.8% gelangumon (Fujifilm Wako Pure Chemical) Muraŝige.kaj Skoog mediumo) kun pH 5,7 kaj kovita je 23 °C sub konstanta lumo.
Strain Tak-1 estis disponigita fare de T. Kohchi (Kioto University) kaj estis utiligita kiel la norma eksperimenta unuo por la hepatostudo.Gemma estis akirita de steriligitaj kultivitaj plantoj kaj tiam tegita sur Gamborg B5-medio (Fujifilm Wako Pure Chemical) enhavanta 1% sakarozon kaj 0.3% gelanan gumon kaj kovita je 23 °C sub kontinua lumo.
Tabakaj BY-2-ĉeloj (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) estis disponigitaj fare de S. Hasezawa (Universitato de Tokio).BY-2-ĉeloj estis diluitaj 95-oble en modifita Linsmeier kaj Skoog-medio kaj kompletigitaj ĉiusemajne kun 2,4-diklorofenoksiacetika acido 32 .La ĉelsuspendo estis miksita sur rotacia skuilo je 130 rpm je 27 °C en la mallumo.Lavu ĉelojn kun 10 fojojn la volumeno de freŝa medio kaj resuspendu en la sama medio.BY-2 transgenaj ĉellinioj stabile esprimanta la mikrotubulmarkon TagRFP-TUA6 aŭ la aktina filamentsigno GFP-ABD2 sub la florbrasika mozaikviruso 35S-reklamanto estis generitaj kiel priskribite33,34,35.Tiuj ĉellinioj povas esti konservitaj kaj sinkronigitaj uzante procedurojn similajn al tiuj uzitaj por la origina BY-2 ĉellinio.
HeLa-ĉeloj estis kultivitaj en la modifita Eagle's medium (DMEM) de Dulbecco (Life Technologies) kompletigita kun 10% feta bova serumo, 1.2 U/ml penicilino, kaj 1.2 μg/ml streptomicino en 37°C inkubatoro kun 5% CO2.
Ĉiuj eksperimentoj priskribitaj en ĉi tiu manuskripto estis faritaj laŭ japanaj biosekurecaj regularoj kaj gvidlinioj.
Kunmetaĵoj estis dissolvitaj en dimetilsulfoksido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kiel akciaj solvaĵoj kaj diluitaj en MS-medio por Arabidopsis kaj tabako aŭ Gamborg B5-medio por hepato.Por la provo de inhibicio de radika kresko, pli ol 10 semoj per telero estis semitaj sur agarmedio enhavanta la indikitajn kunmetaĵojn aŭ DMSO.Semoj estis kovataj en kreska ĉambro dum 7 tagoj.La plantidoj estis fotitaj kaj la longo de la radikoj estis mezurita.Por Arabidopsis ĝermanalizo, 48 semoj per telero estis semitaj sur agarmedio enhavanta 200 μM kunmetaĵon aŭ DMSO.Arabidopsis-semoj estis kultivitaj en kreskkamero kaj la nombro da ĝermitaj plantidoj estis nombrita 7 tagojn post ĝermado (dag).Por tabaka ĝermatesto, 24 semoj per telero estis semitaj sur agarmedio enhavanta 200 μM KAND aŭ DMSO.Tabaksemoj estis kultivitaj en kreskkamero kaj la nombro da ĝermitaj plantidoj estis nombrita post 14 tagoj.Por la provo de inhibicio de kresko de hepato, 9 embrioj de ĉiu telero estis tegitaj sur agarmedio enhavanta la indikitajn koncentriĝojn de KAND aŭ DMSO kaj kovataj en kreskĉambro dum 14 tagoj.
Uzu plantidojn makulitajn per 5 mg/ml propidiojoduro (PI) por bildigi radikmeristeman organizon.PI-signaloj estis observitaj per fluoreskecmikroskopio uzante TCS SPE-konfokusan laseran skanmikroskopon (Leica Microsystems).
Histokemia makulado de radikoj kun β-glucuronidase (GUS) estis farita laŭ la protokolo priskribita de Malami kaj Benfey36.Plantidoj estis fiksitaj en 90% acetono dum la nokto, makulitaj per 0,5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolil-β-d-glucurona acido en GUS-bufro dum 1 horo kaj metitaj en hidratigitan kloraldehidan solvon.(8 g kloralhidrato, 2 ml akvo kaj 1 ml glicerolo) kaj observita per diferenciga interferkontrasta mikroskopio uzante Axio Imager M1-mikroskopon (Carl Zeiss).
Radikaj anguloj estis mezuritaj sur 7-tagaj plantidoj kreskigitaj sur vertikale metitaj teleroj.Mezuru la angulon de la radiko de la direkto de la gravita vektoro kiel priskribite en la paŝo 6.
La aranĝo de kortikalaj mikrotuboj estis observita kiel priskribita, kun malgrandaj modifoj al la protokolo 37 .Kontraŭ-β-tubulin-antikorpo (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) kaj Alexa Fluor 488-konjugaciita kontraŭ-musa IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) estis utiligitaj kiel primaraj kaj sekundaraj antikorpoj ĉe 1:1000 kaj 1:100 diluoj, respektive.Fluoreskecaj bildoj estis akiritaj per TCS SPE-konfokusa lasera skanmikroskopo (Leica Microsystems).Akiru Z-stakojn bildojn kaj kreu maksimumintensajn projekciojn laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.
HeLa-ĉela proliferado-proceso estis farita uzante Cell Counting Kit 8 (Dojindo) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto.
La kresko de E. coli DH5α estis analizita per mezurado de ĉeldenseco en kulturo uzante spektrofotometron je 600 nm (OD600).
Citoskeleta organizo en transgenaj BY-2-ĉeloj estis observita uzante fluoreskecmikroskopon ekipitan per CSU-X1-konfokusa skana aparato (Yokogawa) kaj sCMOS-fotilo (Zyla, Andor Technology).Citoskeleta denseco estis taksita per bildanalizo, kiu kvantigis la procenton de citoskeletaj pikseloj inter citoplasmaj pikseloj en konfokusaj bildoj uzante ImageJ-programaron kiel priskribite38,39.
Por detekti ĉelmorton en BY-2-ĉeloj, alikvoto de la ĉelsuspendo estis kobita kun 0.05% Evans-bluo dum 10 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Selektema Evans-blua makulado de mortaj ĉeloj dependas de eltrudado de la tinkturfarbo de realigeblaj ĉeloj per la nerompita plasmomembrano40.Makulitaj ĉeloj estis observitaj uzante lumkampan mikroskopon (BX53, Olimpo).
HeLa-ĉeloj estis kreskigitaj en DMEM kompletigita kun 10% FBS en humidigita inkubatoro je 37 °C kaj 5% CO2.Ĉeloj estis traktitaj kun 100 μM KAND 11, kumamonamic-acido 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), aŭ 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) dum 6 h je 37 °C.Ĉeloj estis fiksitaj kun MetOH dum 10 minutoj kaj poste kun acetato dum 5 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Fiksaj ĉeloj estis kovataj per β-tubulin-primara antikorpo (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluita en 0.5% BSA/PBS dum 2 horoj, lavitaj 3 fojojn kun TBST, kaj poste kovataj kun Alexa Fluor-kapra antikorpo.488 1 horo.– Muso IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) kaj 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diluitaj en 0.5% BSA/PBS.Post lavado per TBST tri fojojn, makulitaj ĉeloj estis observitaj sur Nikon Eclipse Ti-E inversa mikroskopo.Bildoj estis kaptitaj per malvarmetigita Hamamatsu ORCA-R2 CCD-fotilo uzante MetaMorph-softvaron (Molecular Devices).
Afiŝtempo: Jun-17-2024