La pinnematodo estas kvarantena migranta endoparazito konata pro kaŭzado de severaj ekonomiaj perdoj en pinarbaraj ekosistemoj. La nuna studo revizias la nematicidan agadon de halogenitaj indoloj kontraŭ pinnematodoj kaj ilian agadmekanismon. La nematicidaj aktivecoj de 5-jodoindolo kaj avermektino (pozitiva kontrolo) kontraŭ pinnematodoj estis similaj kaj altaj je malaltaj koncentriĝoj (10 μg/mL). 5-jodoindolo reduktis fekundecon, reproduktan agadon, embrian kaj larvan mortecon, kaj lokomotoran konduton. Molekulaj interagoj de ligandoj kun senvertebrul-specifaj glutamat-dependaj kloridaj kanalaj receptoroj subtenas la ideon, ke 5-jodoindolo, kiel avermektino, forte ligiĝas al la aktiva loko de la receptoro. 5-jodoindolo ankaŭ induktis diversajn fenotipajn deformaĵojn en nematodoj, inkluzive de nenormala organa kolapso/ŝrumpado kaj pliigita vakuoligo. Ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke vakuoloj povas ludi rolon en nematoda metilig-mediaciita morto. Grave, 5-jodoindolo estis netoksa por ambaŭ plantospecioj (brasiko kaj rafano). Tiel, ĉi tiu studo montras, ke apliko de jodoindolo sub mediaj kondiĉoj povas kontroli velkadon de pinoj.
Pinarba nematodo (Bursaphelenchus xylophilus) apartenas al la pinarba nematodoj (PWN), migrantaj endoparazitaj nematodoj konataj pro kaŭzado de severa ekologia damaĝo al pinarbaraj ekosistemoj1. Pina velkmalsano (PWD) kaŭzita de la pinarba nematodo fariĝas grava problemo sur pluraj kontinentoj, inkluzive de Azio kaj Eŭropo, kaj en Nordameriko, la nematodo detruas enkondukitajn pinspeciojn1,2. Pinomalkresko estas grava ekonomia problemo, kaj la perspektivo de ĝia tutmonda disvastiĝo estas maltrankviliga3. La jenaj pinspecioj estas plej ofte atakitaj de la nematodo: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, kaj Pinus radiata4. Pinarba nematodo estas grava malsano, kiu povas mortigi pinojn ene de semajnoj aŭ monatoj post infekto. Krome, ekaperoj de pinnematodoj estas oftaj en diversaj ekosistemoj, do persistaj infektoĉenoj estis establitaj1.
Bursaphelenchus xylophilus estas kvarantena plantparazita nematodo apartenanta al la superfamilio Aphelenchoidea kaj klado 102.5. La nematodo nutriĝas per fungoj kaj reproduktiĝas en la lignaj histoj de pinoj, evoluante en kvar malsamajn larvostadiojn: L1, L2, L3, L4 kaj plenkreskan individuon1,6. Sub kondiĉoj de manĝaĵmanko, la pinnematodo transiras al specialigita larvostadio - dauer, kiu parazitas sian vektoron - la pinŝelan skarabon (Monochamus alternatus) kaj estas transdonita al sanaj pinoj. En sanaj gastigantoj, nematodoj rapide migras tra planthistoj kaj nutriĝas per parenkimaj ĉeloj, kio kondukas al kelkaj alergiaj reagoj, velkado de pinoj kaj morto ene de jaro post infekto1,7,8.
Biologia kontrolo de pinnematodoj delonge estis defio, kun kvarantenaj mezuroj devenantaj de la 20-a jarcento. Nunaj strategioj por kontroli pinnematodojn ĉefe implikas kemiajn traktadojn, inkluzive de lignofumigado kaj implantado de nematicidoj en arbotrunkojn. La plej ofte uzataj nematicidoj estas avermektino kaj avermektina benzoato, kiuj apartenas al la avermektina familio. Ĉi tiuj multekostaj kemiaĵoj estas tre efikaj kontraŭ multaj nematodaj specioj kaj estas konsiderataj medie sekuraj9. Tamen, ripeta uzo de ĉi tiuj nematicidoj supozeble kreos selektan premon, kiu preskaŭ certe kondukos al la apero de rezistemaj pinnematodoj, kiel estis montrita por pluraj insektaj damaĝbestoj, kiel Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella kaj la nematodoj Trichostrongylus colubriformis kaj Ostertagia circumcincta, kiuj iom post iom evoluigis reziston al avermektinoj10,11,12. Tial, rezistancpadronoj devas esti regule studataj kaj nematicidoj kontinue ekzamenataj por trovi alternativajn, kostefikajn kaj medie amikajn mezurojn por kontroli PVD. En la lastaj jardekoj, pluraj aŭtoroj proponis la uzon de plantekstraktoj, esencaj oleoj kaj volatilaĵoj kiel nematodkontrolaj agentoj13,14,15,16.
Ni ĵus montris la nematicidan agadon de indolo, interĉela kaj interregna signala molekulo, en Caenorhabditis elegans 17. Indolo estas ĝeneraligita intraĉela signalo en mikroba ekologio, kontrolante multajn funkciojn, kiuj influas mikroban fiziologion, sporformadon, plasmidan stabilecon, medikamentreziston, biofilmformadon kaj virulencon 18, 19. La agado de indolo kaj ĝiaj derivaĵoj kontraŭ aliaj patogenaj nematodoj ne estis studita. En ĉi tiu studo, ni esploris la nematicidan agadon de 34 indoloj kontraŭ pinnematodoj kaj klarigis la agadmekanismon de la plej potenca 5-jodoindolo uzante mikroskopion, temp-intervalan fotarton kaj molekulajn aldokiĝajn eksperimentojn, kaj taksis ĝiajn toksajn efikojn sur plantoj uzante semĝermadan analizon.
Altaj koncentriĝoj (>1.0 mM) de indolo antaŭe estis raportitaj kiel havantaj nematicidan efikon sur nematodoj17. Post traktado de B. xylophilus (miksitaj vivstadioj) per indolo aŭ 33 malsamaj indolaj derivaĵoj je 1 mM, la morteco de B. xylophilus estis mezurita per kalkulado de vivaj kaj mortaj nematodoj en la kontrola kaj traktita grupoj. Kvin indoloj montris signifan nematicidan agadon; la supervivo de la netraktita kontrolgrupo estis 95 ± 7% post 24 horoj. El la 34 testitaj indoloj, 5-jodoindolo kaj 4-fluoroindolo je 1 mM kaŭzis 100% mortecon, dum 5,6-difluoroindigo, metilindolo-7-karboksilato kaj 7-jodoindolo kaŭzis ĉirkaŭ 50% mortecon (Tabelo 1).
Efiko de 5-jodoindolo sur vakuolformado kaj metabolo de pinarbara nematodo. (A) Efiko de avermektino kaj 5-jodoindolo sur plenkreskaj masklaj nematodoj, (B) L1-stadiaj nematodovoj kaj (C) metabolo de B. xylophilus, (i) vakuoloj ne estis observitaj je 0 horoj, traktado rezultigis (ii) vakuolojn, (iii) amasiĝon de pluraj vakuoloj, (iv) ŝveliĝon de vakuoloj, (v) fuzion de vakuoloj kaj (vi) formadon de gigantaj vakuoloj. Ruĝaj sagoj indikas ŝveliĝon de vakuoloj, bluaj sagoj indikas fuzion de vakuoloj kaj nigraj sagoj indikas gigantajn vakuolojn. Skalbreto = 50 μm.
Krome, ĉi tiu studo ankaŭ priskribis la sinsekvan procezon de metano-induktita morto en pinnematodoj (Figuro 4C). Metanogena morto estas ne-apoptota tipo de ĉelmorto asociita kun la amasiĝo de elstaraj citoplasmaj vakuoloj27. La morfologiaj difektoj observitaj en pinnematodoj ŝajnas esti proksime rilataj al la mekanismo de metano-induktita morto. Mikroskopa ekzameno je malsamaj tempoj montris, ke gigantaj vakuoloj formiĝis post 20 horoj da eksponiĝo al 5-jodoindolo (0.1 mM). Mikroskopaj vakuoloj estis observitaj post 8 horoj da traktado, kaj ilia nombro pliiĝis post 12 horoj. Pluraj grandaj vakuoloj estis observitaj post 14 horoj. Pluraj kunfanditaj vakuoloj estis klare videblaj post 12-16 horoj da traktado, indikante, ke vakuola fuzio estas la bazo de la metanogena mortmekanismo. Post 20 horoj, pluraj gigantaj vakuoloj estis trovitaj tra la vermo. Ĉi tiuj observoj reprezentas la unuan raporton pri metuozo en C. elegans.
En vermoj traktitaj per 5-jodoindolo, vakuolagrego kaj krevo ankaŭ estis observitaj (Fig. 5), kiel evidentiĝas per vermfleksiĝo kaj vakuola liberigo en la medion. Vakuola interrompo ankaŭ estis observita en la ovoŝela membrano, kiu normale estas konservita sendifekta de L2 dum eloviĝo (Aldona Fig. S2). Ĉi tiuj observoj subtenas la implikiĝon de fluida amasiĝo kaj osmoreguliga fiasko, same kiel reigebla ĉela vundo (RCI), en la procezo de vakuola formado kaj supurado (Fig. 5).
Hipotezante la rolon de jodo en la observita vakuolformado, ni esploris la nematicidan agadon de natria jodido (NaI) kaj kalia jodido (KI). Tamen, ĉe koncentriĝoj (0.1, 0.5 aŭ 1 mM), ili ne influis nek la supervivon de nematodoj nek la vakuolformadon (Aldona Figuro S5), kvankam 1 mM KI havis iometan nematicidan efikon. Aliflanke, 7-jodoindolo (1 aŭ 2 mM), kiel 5-jodoindolo, induktis plurajn vakuolojn kaj strukturajn deformaĵojn (Aldona Figuro S6). La du jodoindoloj montris similajn fenotipajn karakterizaĵojn en pinnematodoj, dum NaI kaj KI ne. Interese, indolo ne induktis vakuolformadon en B. xylophilus ĉe la testitaj koncentriĝoj (datumoj ne montritaj). Tiel, la rezultoj konfirmis, ke la indolo-joda komplekso respondecas pri la vakuoligo kaj metabolo de B. xylophilus.
Inter la indoloj testitaj pri nematicida aktiveco, 5-jodoindolo havis la plej altan glitindicon de -5.89 kcal/mol, sekvata de 7-jodoindolo (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindolo (-4.33), kaj indolo (-4.03) (Figuro 6). La forta hidrogena ligado de 5-jodoindolo al leŭcino 218 stabiligas ĝian ligadon, dum ĉiuj aliaj indolaj derivaĵoj ligas al serino 260 per flankĉenaj hidrogenaj ligoj. Inter aliaj modelitaj jodoindoloj, 2-jodoindolo havas ligvaloron de -5.248 kcal/mol, kio ŝuldiĝas al ĝia ĉefa hidrogena ligo kun leŭcino 218. Aliaj konataj ligoj inkluzivas 3-jodoindolon (-4.3 kcal/mol), 4-jodoindolon (-4.0 kcal/mol), kaj 6-fluoroindolon (-2.6 kcal/mol) (Aldona Figuro S8). Plej multaj halogenitaj indoloj kaj la indolo mem, escepte de 5-jodoindolo kaj 2-jodoindolo, formas ligon kun serino 260. La fakto, ke hidrogena ligado kun leŭcino 218 indikas efikan receptor-ligandan ligadon, kiel observite por ivermektino (Aldona Figuro S7), konfirmas, ke 5-jodoindolo kaj 2-jodoindolo, kiel ivermektino, forte ligiĝas al la aktiva loko de la GluCL-receptoro per leŭcino 218 (Figuro 6 kaj Aldona Figuro S8). Ni proponas, ke ĉi tiu ligado estas necesa por konservi la malferman poran strukturon de la GluCL-komplekso kaj ke per forte ligado al la aktiva loko de la GluCL-receptoro, 5-jodoindolo, 2-jodoindolo, avermektino kaj ivermektino tiel tenas la jonkanalon malfermita kaj permesas fluidan sorbadon.
Molekula aldokiĝo de indolo kaj halogenigita indolo al GluCL. Ligorientiĝoj de (A) indolo, (B) 4-fluoroindolo, (C) 7-jodoindolo, kaj (D) 5-jodoindolo-ligandoj al la aktiva loko de GluCL. La proteino estas reprezentita per rubando, kaj la hidrogenaj ligoj de la ĉefa proteino estas montritaj kiel flavaj punktitaj linioj. (A′), (B′), (C′), kaj (D′) montras la interagojn de la respondaj ligoj kun la ĉirkaŭaj aminoacidaj restaĵoj, kaj la hidrogenaj ligoj de la flankĉeno estas indikitaj per rozkoloraj punktitaj sagoj.
Eksperimentoj estis faritaj por taksi la toksan efikon de 5-jodoindolo sur la ĝermadon de brasiko- kaj rafansemoj. 5-jodoindolo (0.05 aŭ 0.1 mM) aŭ avermektino (10 μg/mL) havis malmultan aŭ neniun efikon sur la komenca ĝermado kaj la apero de plantidoj (Figuro 7). Krome, neniu signifa diferenco estis trovita inter la ĝermadrapideco de netraktitaj kontroloj kaj semoj traktitaj per 5-jodoindolo aŭ avermektino. La efiko sur la plilongigo de pivotradikoj kaj la nombro de formitaj flankaj radikoj estis nesignifa, kvankam 1 mM (10-oble ĝia aktiva koncentriĝo) de 5-jodoindolo iomete prokrastis la disvolviĝon de flankaj radikoj. Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke 5-jodoindolo estas netoksa por plantĉeloj kaj ne interrompas la procezojn de planta disvolviĝo ĉe la studitaj koncentriĝoj.
Efiko de 5-jodoindolo sur semĝermado. Ĝermado, ĝermado kaj laterala enradikiĝo de semoj de B. oleracea kaj R. raphanistrum sur Murashige kaj Skoog agarmedio kun aŭ sen avermektino aŭ 5-jodoindolo. Ĝermado estis registrita post 3 tagoj da inkubacio je 22°C.
Ĉi tiu studo raportas plurajn kazojn de nematodmortigo per indoloj. Grave, ĉi tiu estas la unua raporto pri jodoindolo induktanta metiligon (procezo kaŭzita de la amasiĝo de malgrandaj vakuoloj, kiuj iom post iom kuniĝas en gigantajn vakuolojn, poste kondukante al membrano-krevo kaj morto) en pinpingloj, kun jodoindolo montranta signifajn nematicidajn ecojn similajn al tiuj de la komerca nematicida avermektino.
Antaŭe oni raportis, ke indoloj plenumas multajn signalajn funkciojn en prokariotoj kaj eŭkariotoj, inkluzive de biofilma inhibicio/formado, bakteria supervivo kaj patogeneco19,32,33,34. Lastatempe, la eblaj terapiaj efikoj de halogenitaj indoloj, indolaj alkaloidoj kaj duonsintezaj indolaj derivaĵoj altiris ampleksan esploran intereson35,36,37. Ekzemple, oni montris, ke halogenitaj indoloj mortigas persistajn Escherichia coli kaj Staphylococcus aureus ĉelojn37. Krome, estas scienca intereso studi la efikecon de halogenitaj indoloj kontraŭ aliaj specioj, genroj kaj regnoj, kaj ĉi tiu studo estas paŝo al atingado de ĉi tiu celo.
Ĉi tie, ni proponas mekanismon por 5-jodoindolo-induktita letaleco en C. elegans bazitan sur reigebla ĉela vundo (RCI) kaj metiligo (Figuroj 4C kaj 5). Edemaj ŝanĝoj kiel ŝveliĝo kaj vakuola degenero estas indikiloj de RCI kaj metiligo, manifestiĝantaj kiel gigantaj vakuoloj en la citoplasmo48,49. RCI interrompas energiproduktadon per reduktado de ATP-produktado, kaŭzante paneon de la ATPaza pumpilo, aŭ interrompante ĉelmembranojn kaj kaŭzante rapidan enfluon de Na+, Ca2+ kaj akvo50,51,52. Intracitoplasmaj vakuoloj ekestas en bestaj ĉeloj kiel rezulto de fluida amasiĝo en la citoplasmo pro la enfluo de Ca2+ kaj akvo53. Interese, ĉi tiu mekanismo de ĉeldamaĝo estas reigebla se la damaĝo estas provizora kaj la ĉeloj komencas produkti ATP dum certa tempodaŭro, sed se la damaĝo daŭras aŭ plimalboniĝas, la ĉeloj mortas.54 Niaj observoj montras, ke nematodoj traktitaj per 5-jodoindolo ne kapablas restarigi normalan biosintezon post eksponiĝo al streskondiĉoj.
La metilfenotipo induktita de 5-jodoindolo en B. xylophilus eble ŝuldiĝas al la ĉeesto de jodo kaj ĝia molekula distribuo, ĉar 7-jodoindolo havis malpli da inhibicia efiko sur B. xylophilus ol 5-jodoindolo (Tabelo 1 kaj Aldona Figuro S6). Ĉi tiuj rezultoj parte kongruas kun la studoj de Maltese et al. (2014), kiuj raportis, ke translokigo de la piridila nitrogena parto en indolo de la para- al la meta-pozicio aboliciis vakuoligon, kreskinhibicion kaj citotoksecon en U251-ĉeloj, sugestante, ke la interagado de la molekulo kun specifa aktiva loko en la proteino estas kritika27,44,45. La interagoj inter indolo aŭ halogenitaj indoloj kaj GluCL-receptoroj observitaj en ĉi tiu studo ankaŭ subtenas ĉi tiun nocion, ĉar 5- kaj 2-jodoindolo ligiĝis al GluCL-receptoroj pli forte ol la aliaj ekzamenitaj indoloj (Figuro 6 kaj Aldona Figuro S8). Oni trovis, ke la jodo ĉe la dua aŭ kvina pozicio de la indolo ligiĝas al leŭcino 218 de la GluCL-receptoro per hidrogenaj ligoj de la ĉefa ĉeno, dum aliaj halogenitaj indoloj kaj la indolo mem formas malfortajn flankĉenajn hidrogenajn ligojn kun serino 260 (Figuro 6). Ni tial konjektas, ke la lokalizo de la halogeno ludas gravan rolon en la indukto de vakuola degenerado, dum la forta ligado de 5-jodoindolo tenas la jonkanalon malfermita, tiel permesante rapidan fluidan enfluon kaj vakuolan krevon. Tamen, la detala agmekanismo de 5-jodoindolo restas determinita.
Antaŭ praktika apliko de 5-jodoindolo, ĝia toksa efiko sur plantoj devus esti analizita. Niaj eksperimentoj pri semĝermado montris, ke 5-jodoindolo ne havis negativan efikon sur semĝermadon aŭ postajn disvolviĝoprocezojn ĉe la studitaj koncentriĝoj (Figuro 7). Tiel, ĉi tiu studo provizas bazon por la uzo de 5-jodoindolo en la ekologia medio por kontroli la malutilecon de pinnematodoj al pinoj.
Antaŭaj raportoj montris, ke indol-bazita terapio reprezentas eblan aliron por trakti la problemon de antibiotika rezisto kaj kancera progresado55. Krome, indoloj posedas kontraŭbakteriajn, kontraŭkancerajn, antioksidajn, kontraŭinflamatoriajn, kontraŭdiabetajn, antivirusajn, kontraŭproliferajn kaj kontraŭtuberkulajn agadojn kaj povas servi kiel promesplena bazo por medikamentevoluigo56,57. Ĉi tiu studo sugestas por la unua fojo la eblan uzon de jodo kiel kontraŭparazita kaj vermisaĵa agento.
Avermektino estis malkovrita antaŭ tri jardekoj kaj gajnis la Nobel-premion en 2015, kaj ĝia uzo kiel kontraŭvermigilo ankoraŭ aktive daŭras. Tamen, pro la rapida evoluo de rezisto al avermektinoj en nematodoj kaj insektaj damaĝbestoj, necesas alternativa, malaltkosta kaj ekologie amika strategio por kontroli PWN-infekton en pinoj. Ĉi tiu studo ankaŭ raportas la mekanismon per kiu 5-jodoindolo mortigas pinnematodojn kaj ke 5-jodoindolo havas malaltan toksecon al plantĉeloj, kio malfermas bonajn perspektivojn por ĝia estonta komerca apliko.
Ĉiuj eksperimentoj estis aprobitaj de la Etikkomitato de la Universitato Yeungnam, Gyeongsan, Koreio, kaj la metodoj estis plenumitaj laŭ la gvidlinioj de la Etikkomitato de la Universitato Yeungnam.
Ovinkubaciaj eksperimentoj estis faritaj uzante establitajn procedurojn43. Por taksi eloviĝajn indicojn (HR), 1-tagajn plenkreskajn nematodojn (proksimume 100 inojn kaj 100 masklojn) estis translokigitaj al Petri-pladoj enhavantaj la fungon kaj lasitaj kreski dum 24 horoj. Ovoj estis poste izolitaj kaj traktitaj per 5-jodoindolo (0.05 mM kaj 0.1 mM) aŭ avermektino (10 μg/ml) kiel suspendo en sterila distilita akvo. Ĉi tiuj suspendoj (500 μl; proksimume 100 ovoj) estis translokigitaj al la putoj de 24-puta histokultura plato kaj inkubitaj je 22 °C. L2-kalkuloj estis faritaj post 24 horoj da inkubacio sed estis konsiderataj mortaj se la ĉeloj ne moviĝis kiam stimulitaj per fajna platena drato. Ĉi tiu eksperimento estis farita en du etapoj, ĉiu kun ses ripetoj. La datumoj de ambaŭ eksperimentoj estis kombinitaj kaj prezentitaj. La procento de HR estas kalkulita jene:
Larva morteco estis taksita uzante antaŭe evoluigitajn procedurojn. Nematodaj ovoj estis kolektitaj kaj embrioj estis sinkronigitaj per eloviĝo en sterila distilita akvo por generi L2-stadiajn larvojn. Sinkronigitaj larvoj (ĉirkaŭ 500 nematodoj) estis traktitaj per 5-jodoindolo (0.05 mM kaj 0.1 mM) aŭ avermektino (10 μg/ml) kaj breditaj sur B. cinerea Petri-platoj. Post 48 horoj da inkubacio je 22 °C, nematodoj estis kolektitaj en sterila distilita akvo kaj ekzamenitaj por la ĉeesto de L2, L3 kaj L4-stadioj. La ĉeesto de L3 kaj L4-stadioj indikis larvan transformon, dum la ĉeesto de la L2-stadio indikis neniun transformon. Bildoj estis akiritaj uzante la iRiS™ Ciferecan Ĉelan Bildigan Sistemon. Ĉi tiu eksperimento estis farita en du stadioj, ĉiu kun ses ripetoj. La datumoj de ambaŭ eksperimentoj estis kombinitaj kaj prezentitaj.
La tokseco de 5-jodoindolo kaj avermektino al semoj estis taksita per ĝermaj testoj sur Murashige kaj Skoog agaragarplatoj. 62 Semoj de *B. oleracea* kaj *R. raphanistrum* unue estis trempitaj en sterila distilita akvo dum unu tago, lavitaj per 1 ml da 100% etanolo, steriligitaj per 1 ml da 50% komerca blankigilo (3% natria hipoklorito) dum 15 minutoj, kaj lavitaj kvin fojojn per 1 ml da sterila akvo. La steriligitaj semoj estis poste premitaj sur ĝermadagaragarplatojn enhavantajn 0,86 g/l (0,2X) Murashige kaj Skoog-medion kaj 0,7% bakteriologian agaragaron kun aŭ sen 5-jodoindolo aŭ avermektino. La platoj estis poste inkubaciitaj je 22 °C, kaj bildoj estis prenitaj post 3 tagoj da inkubacio. Ĉi tiu eksperimento estis farita en du etapoj, ĉiu el kiuj havis ses ripetojn.
Afiŝtempo: 26-a de februaro 2025