Kresko de la apeksa meristemo de ŝosoj (SAM) estas kritika por la arkitekturo de la tigo. Planthormonojgiberelinoj(GAoj) ludas ŝlosilajn rolojn en kunordigado de plantkresko, sed ilia rolo en la SAM restas malbone komprenata. Ĉi tie, ni evoluigis ratiometrikan biosensilon de GA-signalado per inĝenierado de la DELLA-proteino por subpremi ĝian esencan reguligan funkcion en la GA-transskriba respondo, samtempe konservante ĝian degeneron post GA-rekono. Ni montras, ke ĉi tiu degenero-bazita biosensilo precize registras ŝanĝojn en GA-niveloj kaj ĉela sensado dum disvolviĝo. Ni uzis ĉi tiun biosensilon por mapi GA-signaladan agadon en la SAM. Ni montras, ke altaj GA-signaloj ĉeestas ĉefe en ĉeloj situantaj inter organaj primordoj, kiuj estas antaŭuloj de internodaj ĉeloj. Uzante gajno- kaj perdo-de-funkciaj alirojn, ni plue montras, ke GA reguligas la orientiĝon de la ĉeldividiĝa ebeno, establante la kanonikan ĉelan organizon de internodoj, tiel antaŭenigante internodan specifon en la SAM.
La apeksa meristemo de la ŝoso (SAM), situanta ĉe la apekso de la ŝoso, enhavas niĉon de stamĉeloj, kies aktiveco generas lateralajn organojn kaj tignodojn module kaj ripete dum la tuta vivo de la planto. Ĉiu el ĉi tiuj ripetantaj unuoj, aŭ plantnodoj, inkluzivas internodojn kaj lateralajn organojn ĉe la nodoj, kaj akselajn meristemojn en la foliaj aksiloj1. La kresko kaj organizado de plantnodoj ŝanĝiĝas dum disvolviĝo. Ĉe Arabidopsis, internoda kresko estas subpremita dum la vegetativa stadio, kaj akselaj meristemoj restas dormantaj en la aksiloj de rozetaj folioj. Dum la transiro al la flora fazo, la SAM fariĝas la infloreska meristemo, generante plilongigitajn internodojn kaj akselajn burĝonojn, branĉetojn en la aksiloj de kaŭlinaj folioj, kaj poste, senfoliajn florojn2. Kvankam ni faris signifan progreson en la kompreno de la mekanismoj, kiuj kontrolas la komencon de folioj, floroj kaj branĉoj, relative malmulte oni scias pri kiel internodoj ekestas.
Kompreni la spactempan distribuon de GAoj helpos pli bone kompreni la funkciojn de ĉi tiuj hormonoj en malsamaj histoj kaj ĉe malsamaj evoluaj stadioj. Bildigo de la degenero de RGA-GFP-fuzio esprimita sub la ago de sia propra promotoro provizas gravajn informojn pri la reguligo de totalaj GA-niveloj en radikoj15,16. Tamen, RGA-esprimo varias trans histoj17 kaj estas reguligita de GA18. Tiel, diferenciga esprimo de la RGA-promotoro povas rezultigi la fluoreskan padronon observitan per RGA-GFP kaj tial ĉi tiu metodo ne estas kvanta. Pli lastatempe, bioaktiva fluoresceino (Fl)-markita GA19,20 rivelis la amasiĝon de GA en la radika endokortekso kaj la reguligon de ĝiaj ĉelaj niveloj per GA-transporto. Lastatempe, la GA FRET-sensilo nlsGPS1 montris, ke GA-niveloj korelacias kun ĉela plilongigo en radikoj, filamentoj kaj malhelkreskintaj hipokotiloj21. Tamen, kiel ni vidis, GA-koncentriĝo ne estas la sola parametro kontrolanta GA-signalan agadon, ĉar ĝi dependas de kompleksaj sensaj procezoj. Ĉi tie, konstruante sur nia kompreno pri la DELLA kaj GA signalado-vojoj, ni raportas la disvolviĝon kaj karakterizadon de degenero-bazita ratiometria biosensilo por GA signalado. Por disvolvi ĉi tiun kvantan biosensilon, ni uzis mutacian GA-senteman RGA, kiu estis kunfandita al fluoreska proteino kaj ĉieesprime esprimita en histoj, same kiel GA-nesenteman fluoreskan proteinon. Ni montras, ke la mutaciaj RGA-proteinaj kunfandoj ne interrompas endogenan GA-signaladon kiam ĉieesprime esprimitaj, kaj ke ĉi tiu biosensilo povas kvantigi signalan agadon rezultantan kaj de GA-enigo kaj de GA-signalprilaborado fare de la sentaparato kun alta spactempa rezolucio. Ni uzis ĉi tiun biosensilon por mapi la spactempan distribuon de GA-signalagado kaj kvantigi kiel GA reguligas ĉelan konduton en la SAM-epidermo. Ni montras, ke GA reguligas la orientiĝon de la divida ebeno de SAM-ĉeloj situantaj inter organaj primordioj, tiel difinante la kanonikan ĉelan organizon de la internodo.
Fine, ni demandis ĉu qmRGA povus raporti ŝanĝojn en endogenaj GA-niveloj uzante kreskantajn hipokotilojn. Ni antaŭe montris, ke nitrato stimulas kreskon per pliigo de GA-sintezo kaj, siavice, DELLA34-degradado. Sekve, ni observis, ke la longo de hipokotilo en pUBQ10::qmRGA-plantidoj kultivitaj sub abunda nitrata provizo (10 mM NO3−) estis signife pli longa ol tiu en plantidoj kultivitaj sub nitrat-mankaj kondiĉoj (Aldona Figuro 6a). Kongrue kun la kreskorespondo, GA-signaloj estis pli altaj en hipokotiloj de plantidoj kultivitaj sub 10 mM NO3−-kondiĉoj ol en plantidoj kultivitaj en la foresto de nitrato (Aldona Figuro 6b, c). Tiel, qmRGA ankaŭ ebligas monitoradon de ŝanĝoj en GA-signalado induktitaj de endogenaj ŝanĝoj en GA-koncentriĝo.
Por kompreni ĉu la GA-signala aktiveco detektita de qmRGA dependas de GA-koncentriĝo kaj GA-percepto, kiel atendite surbaze de la sensila dezajno, ni analizis la esprimon de la tri GID1-receptoroj en vegetativaj kaj generaj histoj. En plantidoj, la GID1-GUS-raportista linio montris, ke GID1a kaj c estis alte esprimitaj en kotiledonoj (Fig. 3a-c). Krome, ĉiuj tri receptoroj estis esprimitaj en folioj, flankaj radikaj primordoj, radikpintoj (krom la radika ĉapo de GID1b), kaj la vaskula sistemo (Fig. 3a-c). En la infloreska SAM, ni detektis GUS-signalojn nur por GID1b kaj 1c (Aldona Fig. 7a-c). En situ hibridigo konfirmis ĉi tiujn esprimajn ŝablonojn kaj plue montris, ke GID1c estis unuforme esprimita je malaltaj niveloj en la SAM, dum GID1b montris pli altan esprimon ĉe la periferio de la SAM (Aldona Fig. 7d-l). La traduka fuzio pGID1b::2xmTQ2-GID1b ankaŭ rivelis gradigitan gamon de GID1b-esprimo, de malalta aŭ neniu esprimo en la centro de la SAM ĝis alta esprimo ĉe la organaj limoj (Aldona Figuro 7m). Tiel, GID1-receptoroj ne estas unuforme distribuitaj tra kaj ene de histoj. En postaj eksperimentoj, ni ankaŭ observis, ke troesprimo de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) pliigis la sentemon de qmRGA en hipokotiloj al ekstera GA-apliko (Figuro 3d, e). Kontraste, fluoreskeco mezurita per qd17mRGA en la hipokotilo estis imuna al GA3-traktado (Figuro 3f, g). Por ambaŭ provoj, plantidoj estis traktitaj per altaj koncentriĝoj de GA (100 μM GA3) por taksi la rapidan konduton de la sensilo, kie la kapablo ligi al la GID1-receptoro estis plifortigita aŭ perdita. Kune, ĉi tiuj rezultoj konfirmas, ke la qmRGA-biosensilo servas kombinitan funkcion kiel GA kaj GA-sensilo, kaj sugestas, ke diferenciga esprimo de la GID1-receptoro povas signife moduli la emisiemon de la sensilo.
Ĝis nun, la distribuo de GA-signaloj en la SAM restas neklara. Tial, ni uzis qmRGA-esprimantajn plantojn kaj la pCLV3::mCherry-NLS stamĉelan raportiston35 por kalkuli alt-rezoluciajn kvantajn mapojn de GA-signala aktiveco, fokusante sur la L1-tavolo (epidermo; Fig. 4a, b, vidu Metodojn kaj Suplementajn Metodojn), ĉar L1 ludas ŝlosilan rolon en kontrolado de SAM-kresko36. Ĉi tie, la pCLV3::mCherry-NLS-esprimo provizis fiksan geometrian referencpunkton por analizi la spactempan distribuon de GA-signala aktiveco37. Kvankam GA estas konsiderata esenca por laterala organa disvolviĝo4, ni observis, ke GA-signaloj estis malaltaj en la flora primordio (P) komencante de la P3-stadio (Fig. 4a, b), dum junaj P1- kaj P2-primordioj havis moderan aktivecon similan al tiu en la centra regiono (Fig. 4a, b). Pli alta GA-signala aktiveco estis detektita ĉe la limoj de la organaj primordioj, komencante ĉe P1/P2 (ĉe la flankoj de la limo) kaj pintante ĉe P4, same kiel en ĉiuj ĉeloj de la periferia regiono situanta inter la primordioj (Fig. 4a, b kaj Aldona Fig. 8a, b). Ĉi tiu pli alta GA-signala aktiveco estis observita ne nur en la epidermo sed ankaŭ en la L2 kaj supraj L3 tavoloj (Aldona Fig. 8b). La ŝablono de GA-signaloj detektitaj en la SAM uzante qmRGA ankaŭ restis senŝanĝa laŭlonge de la tempo (Aldona Fig. 8c-f, k). Kvankam la qd17mRGA-konstrukcio estis sisteme malsuprenreguligita en la SAM de T3-plantoj de kvin sendependaj linioj, kiujn ni karakterizis detale, ni povis analizi la fluoreskajn ŝablonojn akiritajn per la pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstrukcio (Aldona Fig. 8g-j, l). En ĉi tiu kontrollinio, nur malgrandaj ŝanĝoj en la fluoreska proporcio estis detektitaj en la SAM, sed en la SAM-centro ni observis klaran kaj neatenditan malpliiĝon de VENUS asociita kun TagBFP. Ĉi tio konfirmas, ke la signalpadrono observita per qmRGA reflektas GA-dependan degeneron de mRGA-VENUS, sed ankaŭ montras, ke qmRGA eble supertaksas GA-signalan agadon en la meristema centro. Resumante, niaj rezultoj malkaŝas GA-signalan padronon, kiu ĉefe reflektas la distribuon de primordioj. Ĉi tiu distribuo de la inter-praa regiono (IPR) ŝuldiĝas al la laŭpaŝa establado de alta GA-signala agado inter la evoluanta primordio kaj la centra regiono, dum samtempe GA-signala agado en la primordio malpliiĝas (Fig. 4c, d).
La distribuo de GID1b kaj GID1c receptoroj (vidu supre) sugestas, ke diferenciga esprimo de GA-receptoroj helpas formi la ŝablonon de GA-signala agado en la SAM. Ni scivolis, ĉu diferenciga akumuliĝo de GA eble estas implikita. Por esplori ĉi tiun eblecon, ni uzis la nlsGPS1 GA FRET sensilon21. Pliigita aktiviga frekvenco estis detektita en la SAM de nlsGPS1 traktita per 10 μM GA4+7 dum 100 minutoj (Aldona Figuro 9a-e), indikante, ke nlsGPS1 reagas al ŝanĝoj en GA-koncentriĝo en la SAM, kiel ĝi faras en radikoj21. Spaca distribuo de la aktiviga frekvenco de nlsGPS1 rivelis relative malaltajn GA-nivelojn en la eksteraj tavoloj de la SAM, sed montris, ke ili estis levitaj en la centro kaj ĉe la randoj de la SAM (Figuro 4e kaj Aldona Figuro 9a,c). Ĉi tio sugestas, ke GA ankaŭ estas distribuita en la SAM kun spaca ŝablono komparebla al tiu rivelita per qmRGA. Kiel komplementa aliro, ni ankaŭ traktis la SAM per fluoreska GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) aŭ Fl sole kiel negativa kontrolo. La Fl-signalo estis distribuita tra la SAM, inkluzive de la centra regiono kaj primordio, kvankam je pli malalta intenseco (Fig. 4j kaj Aldona Fig. 10d). Kontraste, ĉiuj tri GA-Fl akumuliĝis specife ene de la primordia limoj kaj je diversaj gradoj en la resto de la IPR, kun GA7-Fl akumuliĝanta en la plej granda domajno en la IPR (Fig. 4k kaj Aldona Fig. 10a,b). Kvantigo de fluoreska intenseco rivelis, ke la proporcio de IPR al ne-IPR-intenseco estis pli alta en GA-Fl-traktita SAM kompare kun Fl-traktita SAM (Fig. 4l kaj Aldona Fig. 10c). Kune, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke GA ĉeestas je pli altaj koncentriĝoj en IPR-ĉeloj, kiuj situas plej proksime al la organa limo. Ĉi tio sugestas, ke la ŝablono de SAM GA-signalada agado rezultas kaj el diferenciga esprimo de GA-receptoroj kaj el diferenciga amasiĝo de GA en IPR-ĉeloj proksime de organaj limoj. Tiel, nia analizo rivelis neatenditan spactempan ŝablonon de GA-signalado, kun pli malalta aktiveco en la centro kaj primordio de la SAM kaj pli alta aktiveco en la IPR en la periferia regiono.
Por kompreni la rolon de diferenciga GA-signala aktiveco en la SAM, ni analizis la korelacion inter GA-signala aktiveco, ĉelkresko kaj ĉeldividiĝo uzante realtempan temp-intervalan bildigon de la SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Konsiderante la rolon de GA en kreskoreguligo, oni atendis pozitivan korelacion kun ĉelkreskaj parametroj. Tial, ni unue komparis GA-signalajn agadmapojn kun mapoj de ĉelsurfaca kreskorapideco (kiel anstataŭanto por la forto de ĉelkresko por difinita ĉelo kaj por filinaj ĉeloj ĉe divido) kaj kun mapoj de kreska anizotropio, kiu mezuras la direktecon de ĉelkresko (ankaŭ uzata ĉi tie por difinita ĉelo kaj por filinaj ĉeloj ĉe divido; Fig. 5a,b, vidu Metodojn kaj Suplementajn Metodojn). Niaj mapoj de SAM-ĉelsurfaca kreskorapideco kongruas kun antaŭaj observoj38,39, kun minimumaj kreskorapidecoj ĉe la limo kaj maksimumaj kreskorapidecoj en evoluantaj floroj (Fig. 5a). Analizo de ĉefaj komponantoj (PCA) montris, ke GA-signala aktiveco estis negative korelaciita kun ĉelsurfaca kreskointenseco (Figuro 5c). Ni ankaŭ montris, ke la ĉefaj aksoj de variado, inkluzive de GA-signala enigo kaj kreskintenseco, estis ortaj al la direkto determinita de alta CLV3-esprimo, konfirmante la ekskludon de ĉeloj el la SAM-centro en la ceteraj analizoj. Analizo de Spearman-korelacio konfirmis la PCA-rezultojn (Figuro 5d), indikante, ke pli altaj GA-signaloj en la IPR ne rezultigis pli altan ĉelan ekspansion. Tamen, korelacio-analizo rivelis iometan pozitivan korelacion inter GA-signala aktiveco kaj kreskanizotropio (Figuro 5c, d), sugestante, ke pli alta GA-signalado en la IPR influas la direkton de ĉelkresko kaj eble la pozicion de la ĉeldividiĝa ebeno.
a, b Varmecaj mapoj de meza surfaca kresko (a) kaj kreska anizotropio (b) en SAM averaĝitaj super sep sendependaj plantoj (uzataj kiel proksimumaj indikiloj por la forto kaj direkto de ĉela ekspansio, respektive). c PCA-analizo inkluzivis la jenajn variablojn: GA-signalo, surfaca kreskintenseco, surfaca kreskanizotropio kaj CLV3-esprimo. PCA-komponanto 1 estis ĉefe negative korelaciita kun surfaca kreskintenseco kaj pozitive korelaciita kun GA-signalo. PCA-komponanto 2 estis ĉefe pozitive korelaciita kun surfaca kreskanizotropio kaj negative korelaciita kun CLV3-esprimo. Procentoj reprezentas la varion klarigitan per ĉiu komponanto. d Spearman-korelacia analizo inter GA-signalo, surfaca kreskintenseco kaj surfaca kreskanizotropio je la hista skalo ekskludante CZ. La nombro dekstre estas la Spearman-rho-valoro inter du variabloj. Asteriskoj indikas kazojn kie la korelacio/negativa korelacio estas tre signifa. e 3D-bildigo de Col-0 SAM L1-ĉeloj per konfokusa mikroskopio. Novaj ĉelmuroj formitaj en la SAM (sed ne la primordio) je 10 horoj estas koloritaj laŭ siaj angulaj valoroj. La kolorbreto estas montrita en la malsupra dekstra angulo. La enmetita bildo montras la respondan 3D-bildon je 0 h. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj. f Skatoldiagramoj montras ĉeldividiĝajn rapidojn en IPR kaj ne-IPR Col-0 SAM (n = 10 sendependaj plantoj). La centra linio montras la medianon, kaj la skatollimoj indikas la 25-an kaj 75-an percentilojn. Lipharoj indikas la minimumajn kaj maksimumajn valorojn determinitajn per R-programaro. P-valoroj estis akiritaj per la duvosta t-testo de Welch. g, h Skemo montranta (g) kiel mezuri la angulon de la nova ĉelmuro (magento) rilate al la radiala direkto de la centro de la SAM (blanka punktita linio) (nur akutaj angulaj valoroj, t.e., 0–90°, estas konsiderataj), kaj (h) la ĉirkaŭferencajn/lateralajn kaj radialajn direktojn ene de la meristemo. i Frekvencaj histogramoj de ĉeldividiĝa ebena orientiĝo trans la SAM (malhelblua), IPR (meza blua), kaj ne-IPR (helblua), respektive. P-valoroj estis akiritaj per duvosta Kolmogorov-Smirnov-testo. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj. j Frekvencaj histogramoj de la ĉeldividiĝa ebena orientiĝo de la IPR ĉirkaŭ P3 (helverda), P4 (meza verda), kaj P5 (malhelverda), respektive. P-valoroj estis akiritaj per duvosta Kolmogorov-Smirnov-testo. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj.
Tial, ni poste esploris la korelacion inter GA-signalado kaj ĉeldividiĝa aktiveco per identigo de nove formitaj ĉelmuroj dum la analizo (Fig. 5e). Ĉi tiu aliro permesis al ni mezuri la oftecon kaj direkton de ĉeldividiĝo. Surprize, ni trovis, ke la ofteco de ĉeldividiĝoj en la IPR kaj la resto de la SAM (ne-IPR, Fig. 5f) estis simila, indikante, ke diferencoj en GA-signalado inter IPR kaj ne-IPR ĉeloj ne signife influas ĉeldividiĝon. Ĉi tio, kaj la pozitiva korelacio inter GA-signalado kaj kreska anizotropio, instigis nin konsideri ĉu GA-signalada aktiveco povus influi la orientiĝon de la ĉeldividiĝa ebeno. Ni mezuris la orientiĝon de la nova ĉelmuro kiel akutan angulon rilate al la radiala akso, kiu konektas la centron de la meristemo kaj la centron de la nova ĉelmuro (Fig. 5e-i) kaj observis klaran tendencon por ĉeloj dividiĝi laŭ anguloj proksimaj al 90° rilate al la radiala akso, kun la plej altaj frekvencoj observitaj je 70–80° (23.28%) kaj 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i), respondantaj al ĉeldividiĝoj en la ĉirkaŭa/transversa direkto (Fig. 5h). Por ekzameni la kontribuon de GA-signalado al ĉi tiu ĉeldividiĝa konduto, ni analizis ĉeldividiĝajn parametrojn en la IPR kaj ne-IPR aparte (Fig. 5i). Ni observis, ke la distribuo de la dividaj anguloj en IPR-ĉeloj diferencis de tiu en ne-IPR-ĉeloj aŭ en ĉeloj en la tuta SAM, kun IPR-ĉeloj montrantaj pli altan proporcion de lateralaj/cirklaj ĉeldividiĝoj, t.e., 70–80° kaj 80–90° (33,86% kaj 30,71%, respektive, respondaj proporcioj) (Fig. 5i). Tiel, niaj observoj rivelis asocion inter alta GA-signalado kaj orientiĝo de la ĉeldividiĝa ebeno proksima al la ĉirkaŭa direkto, simile al la korelacio inter GA-signalada aktiveco kaj kreska anizotropio (Fig. 5c, d). Por plue establi la spacan konservadon de ĉi tiu asocio, ni mezuris la orientiĝon de la dividaj ebenoj en IPR-ĉeloj ĉirkaŭ la primordio komencante de P3, ĉar la plej alta GA-signalada aktiveco estis detektita en ĉi tiu regiono komencante de P4 (Fig. 4). La dividaj anguloj de la IPR ĉirkaŭ P3 kaj P4 montris neniujn statistike signifajn diferencojn, kvankam pliigita ofteco de lateralaj ĉeldividiĝoj estis observita en la IPR ĉirkaŭ P4 (Fig. 5j). Tamen, en la IPR-ĉeloj ĉirkaŭ P5, la diferenco en la orientiĝo de la ĉeldividiĝa ebeno fariĝis statistike signifa, kun akra pliiĝo en la ofteco de transversaj ĉeldividiĝoj (Fig. 5j). Kune, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke GA-signalado povas kontroli la orientiĝon de ĉeldividiĝoj en la SAM, kio kongruas kun antaŭaj raportoj40,41, ke alta GA-signalado povas indukti lateralan orientiĝon de ĉeldividiĝoj en la IPR.
Estas antaŭdirite, ke ĉeloj en la IPR ne estos integritaj en primodiojn, sed prefere en internodojn2,42,43. La transversa orientiĝo de ĉeldividiĝoj en la IPR povas rezultigi la tipan organizadon de paralelaj longitudaj vicoj de epidermaj ĉeloj en internodoj. Niaj observoj priskribitaj supre sugestas, ke GA-signalado verŝajne ludas rolon en ĉi tiu procezo per reguligo de la direkto de ĉeldividiĝo.
Perdo de funkcio de pluraj DELLA-genoj rezultas en konstituiga GA-respondo, kaj della-mutantoj povas esti uzataj por testi ĉi tiun hipotezon44. Ni unue analizis la esprimajn ŝablonojn de kvin DELLA-genoj en la SAM. Transskriba fuzio de la GUS-linio45 rivelis, ke GAI, RGA, RGL1, kaj RGL2 (je multe pli malgranda mezuro) estis esprimitaj en la SAM (Aldona Figuro 11a-d). En situ hibridigo plue montris, ke GAI-mRNA akumuliĝas specife en primordioj kaj evoluantaj floroj (Aldona Figuro 11e). RGL1 kaj RGL3-mRNA estis detektitaj tra la tuta SAM-kanopeo kaj en pli maljunaj floroj, dum RGL2-mRNA estis pli abunda en la randregiono (Aldona Figuro 11f-h). Konfokusa bildigo de pRGL3::RGL3-GFP SAM konfirmis la esprimon observitan per en situ hibridigo kaj montris, ke RGL3-proteino akumuliĝas en la centra parto de la SAM (Aldona Figuro 11i). Uzante la linion pRGA::GFP-RGA, ni ankaŭ trovis, ke RGA-proteino akumuliĝas en la SAM, sed ĝia abundo malpliiĝas ĉe la limo komencante de P4 (Aldona Figuro 11j). Rimarkinde, la esprimaj ŝablonoj de RGL3 kaj RGA kongruas kun pli alta GA-signala aktiveco en la IPR, kiel detektite per qmRGA (Figuro 4). Krome, ĉi tiuj datumoj indikas, ke ĉiuj DELLA-oj estas esprimitaj en la SAM kaj ke ilia esprimo kolektive ampleksas la tutan SAM.
Poste ni analizis la parametrojn de ĉeldividiĝo en la sovaĝ-tipa SAM (Ler, kontrolo) kaj la gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della kvinobla (tutmonda) mutantoj (Fig. 6a, b). Interese, ni observis statistike signifan ŝanĝon en la distribuo de ĉeldividiĝaj angulaj frekvencoj en la della tutmonda mutanto SAM kompare kun la sovaĝa tipo (Fig. 6c). Ĉi tiu ŝanĝo en la della tutmonda mutanto ŝuldiĝis al pliiĝo en la frekvenco de 80–90° anguloj (34.71% kontraŭ 24.55%) kaj, malpli grandparte, 70–80° anguloj (23.78% kontraŭ 20.18%), t.e., respondantaj al transversaj ĉeldividiĝoj (Fig. 6c). La frekvenco de ne-transversaj dividoj (0–60°) ankaŭ estis pli malalta en la della tutmonda mutanto (Fig. 6c). La frekvenco de transversaj ĉeldividiĝoj estis signife pliigita en la SAM de la della tutmonda mutanto (Fig. 6b). La ofteco de transversaj ĉeldividiĝoj en la IPR estis ankaŭ pli alta en la della tutmonda mutanto kompare kun la sovaĝa tipo (Fig. 6d). Ekster la IPR-regiono, la sovaĝa tipo havis pli unuforman distribuon de ĉeldividiĝaj anguloj, dum la della tutmonda mutanto preferis tanĝantajn dividojn kiel la IPR (Fig. 6e). Ni ankaŭ kvantigis la orientiĝon de ĉeldividiĝoj en la SAM de ga2-oksidazaj (ga2ox) kvinoblaj mutantoj (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, kaj ga2ox6-2), GA-neaktiva mutanta fono en kiu GA akumuliĝas. Kongrue kun la pliiĝo de GA-niveloj, la SAM de la kvinobla ga2ox-mutacia infloresko estis pli granda ol tiu de Col-0 (Aldona Figuro 12a, b), kaj kompare kun Col-0, la kvinobla ga2ox-SAM montris klare malsaman distribuon de ĉeldividiĝaj anguloj, kun la angula frekvenco pliiĝanta de 50° ĝis 90°, t.e. denove favorante tanĝantajn dividojn (Aldona Figuro 12a-c). Tiel, ni montras, ke konstitua aktivigo de GA-signalado kaj GA-akumuliĝo induktas lateralajn ĉeldividojn en la IPR kaj la resto de la SAM.
a, b 3D-bildigo de la L1-tavolo de PI-makulita Ler (a) kaj tutmonda della mutaciulo (b) SAM uzante konfokusan mikroskopion. Novaj ĉelmuroj formitaj en la SAM (sed ne la primordio) dum 10-hora periodo estas montritaj kaj kolorigitaj laŭ siaj angulaj valoroj. La enmetitaĵo montras la SAM je 0 h. La kolorbreto estas montrata en la malsupra dekstra angulo. La sago en (b) montras al ekzemplo de vicigitaj ĉeldosieroj en la tutmonda della mutaciulo. La eksperimento estis ripetata dufoje kun similaj rezultoj. ce-komparo de la frekvenca distribuo de orientiĝoj de ĉeldividiĝaj ebenoj en la tuta SAM (d), IPR (e), kaj ne-IPR (f) inter Ler kaj tutmonda della. P-valoroj estis akiritaj uzante duvostan Kolmogorov-Smirnov-teston. f, g 3D-bildigo de konfokusaj bildoj de PI-makulita SAM de Col-0 (i) kaj pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenaj plantoj. Paneloj (a, b) montras novajn ĉelajn murojn (sed ne primordiojn) formitajn en la SAM ene de 10 horoj. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj. h–j Komparo de la frekvenca distribuo de orientiĝoj de ĉeldividiĝaj ebenoj en la tuta SAM (h), IPR (i) kaj ne-IPR (j) inter Col-0 kaj pCUC2::gai-1-VENUS plantoj. P-valoroj estis akiritaj uzante duvostan Kolmogorov-Smirnov-teston.
Poste ni testis la efikon de inhibicio de GA-signalado specife en la IPR. Por ĉi tiu celo, ni uzis la kotiledonan taso 2 (CUC2) reklamanton por stiri esprimon de dominante negativa gai-1-proteino kunfandita al VENUS (en la pCUC2::gai-1-VENUS linio). En la sovaĝ-tipa SAM, la CUC2 reklamanto stiras esprimon de plej multaj IPR-oj en la SAM, inkluzive de limĉeloj, de P4 pluen, kaj simila specifa esprimo estis observita en pCUC2::gai-1-VENUS plantoj (vidu sube). La distribuo de ĉeldividiĝaj anguloj trans la SAM aŭ IPR de pCUC2::gai-1-VENUS plantoj ne estis signife malsama ol tiu de la sovaĝ-tipo, kvankam neatendite ni trovis, ke ĉeloj sen IPR en ĉi tiuj plantoj dividiĝis je pli alta frekvenco de 80–90° (Fig. 6f–j).
Oni sugestis, ke la direkto de ĉeldividiĝo dependas de la geometrio de la SAM, precipe la streĉa streĉo generita de la kurbeco de la histo46. Ni tial demandis, ĉu la formo de la SAM estis ŝanĝita en la della tutmonda mutaciulo kaj pCUC2::gai-1-VENUS plantoj. Kiel antaŭe raportite12, la grandeco de la della tutmonda mutaciulo SAM estis pli granda ol tiu de la sovaĝa tipo (Aldona Fig. 13a, b, d). En situ hibridigo de CLV3 kaj STM RNA konfirmis la meristeman ekspansion en della mutaciuloj kaj plue montris la lateralan ekspansion de la stamĉela niĉo (Aldona Fig. 13e, f, h, i). Tamen, la kurbeco de la SAM estis simila en ambaŭ genotipoj (Aldona Fig. 13k, m, n, p). Ni observis similan pligrandiĝon en la gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della kvarobla mutaciulo sen ŝanĝo en kurbeco kompare kun la sovaĝa tipo (Aldona Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). La ofteco de ĉeldividiĝa orientiĝo ankaŭ estis influita en la della kvarobla mutaciulo, sed malpligrade ol en la della monolita mutaciulo (Aldona Figuro 12d–f). Ĉi tiu doza efiko, kune kun la manko de efiko sur kurbeco, sugestas, ke resta RGL3-aktiveco en la Della kvarobla mutaciulo limigas ŝanĝojn en ĉeldividiĝa orientiĝo kaŭzitaj de perdo de DELLA-aktiveco kaj ke ŝanĝoj en lateralaj ĉeldividiĝoj okazas kiel respondo al ŝanĝoj en GA-signalada aktiveco prefere ol ŝanĝoj en SAM-geometrio. Kiel priskribite supre, la CUC2-reklamanto pelas IPR-esprimon en la SAM komencante ĉe P4 (Aldona Figuro 14a, b), kaj kontraste, la pCUC2::gai-1-VENUS SAM havis reduktitan grandecon sed pli altan kurbecon (Aldona Figuro 14c–h). Ĉi tiu ŝanĝo en la pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologio povas rezultigi malsaman distribuon de mekanikaj streĉoj kompare kun la sovaĝa tipo, en kiu altaj ĉirkaŭferencaj streĉoj komenciĝas je pli mallonga distanco de la SAM-centro47. Alternative, la ŝanĝoj en la morfologio de pCUC2::gai-1-VENUS SAM povus rezulti el ŝanĝoj en regionaj mekanikaj ecoj induktitaj de transgena esprimo48. En ambaŭ kazoj, tio povus parte kompensi la efikojn de ŝanĝoj en GA-signalado per pliigo de la probableco, ke ĉeloj dividiĝos en la ĉirkaŭa/transversa orientiĝo, klarigante niajn observojn.
Sume, niaj datumoj konfirmas, ke pli alta GA-signalado ludas aktivan rolon en la laterala orientiĝo de la ĉeldividiĝa ebeno en la IPR. Ili ankaŭ montras, ke meristema kurbeco ankaŭ influas la orientiĝon de la ĉeldividiĝa ebeno en la IPR.
La transversa orientiĝo de la divida ebeno en la IPR, pro alta GA-signala aktiveco, sugestas, ke GA antaŭorganizas radialan ĉeldosieron en la epidermo ene de la SAM por difini la ĉelan organizon, kiu poste troviĝos en la epiderma internodo. Efektive, tiaj ĉeldosieroj estis ofte videblaj en SAM-bildoj de della tutmondaj mutacioj (Fig. 6b). Tiel, por plue esplori la disvolviĝan funkcion de la spaca ŝablono de GA-signalado en la SAM, ni uzis temp-intervalan bildigon por analizi la spacan organizon de ĉeloj en la IPR en sovaĝtipaj (Ler kaj Col-0), della tutmondaj mutacioj, kaj pCUC2::gai-1-VENUS transgenaj plantoj.
Ni trovis, ke qmRGA montris, ke GA-signala aktiveco en la IPR pliiĝis de P1/P2 kaj pintis je P4, kaj ĉi tiu padrono restis konstanta laŭlonge de la tempo (Fig. 4a-f kaj Suplementa Fig. 8c-f, k). Por analizi la spacan organizon de ĉeloj en la IPR kun kreskanta GA-signalo, ni etikedis Ler IPR-ĉelojn super kaj flanke de P4 laŭ ilia evolua sorto analizita 34 horojn post la unua observado, t.e., pli ol du plastidajn fojojn, permesante al ni sekvi IPR-ĉelojn dum la evoluado de la primordio de P1/P2 ĝis P4. Ni uzis tri malsamajn kolorojn: flava por tiuj ĉeloj, kiuj estis integritaj en la primordiumon proksime de P4, verda por tiuj, kiuj estis en la IPR, kaj viola por tiuj, kiuj partoprenis en ambaŭ procezoj (Fig. 7a-c). Je t0 (0 h), 1-2 tavoloj de IPR-ĉeloj estis videblaj antaŭ P4 (Fig. 7a). Kiel atendite, kiam ĉi tiuj ĉeloj dividiĝis, ili faris tion ĉefe per la transversa divida ebeno (Fig. 7a-c). Similaj rezultoj estis akiritaj uzante Col-0 SAM (fokusante sur P3, kies rando faldiĝas simile al P4 en Ler), kvankam en ĉi tiu genotipo la faldo formita ĉe la flora rando kaŝis la IPR-ĉelojn pli rapide (Fig. 7g–i). Tiel, la dividpadrono de IPR-ĉeloj antaŭorganizas la ĉelojn en radialajn vicojn, kiel en internodoj. La organizado de radialaj vicoj kaj la lokalizo de IPR-ĉeloj inter sinsekvaj organoj sugestas, ke ĉi tiuj ĉeloj estas internodaj praĉeloj.
Ĉi tie, ni evoluigis ratiometrikan GA-signalan biosensilon, qmRGA, kiu permesas kvantan mapadon de GA-signala agado rezultanta el kombinitaj GA kaj GA-receptoraj koncentriĝoj, minimumigante interferon kun endogenaj signalaj vojoj, tiel provizante informojn pri GA-funkcio je la ĉela nivelo. Por ĉi tiu celo, ni konstruis modifitan DELLA-proteinon, mRGA, kiu perdis la kapablon ligi DELLA-interagajn partnerojn, sed restas sentema al GA-induktita proteolizo. qmRGA respondas al kaj eksogenaj kaj endogenaj ŝanĝoj en GA-niveloj, kaj ĝiaj dinamikaj sensaj ecoj ebligas taksadon de spactempaj ŝanĝoj en GA-signala agado dum disvolviĝo. qmRGA ankaŭ estas tre fleksebla ilo, ĉar ĝi povas esti adaptita al malsamaj histoj ŝanĝante la promotoron uzatan por ĝia esprimo (se necese), kaj konsiderante la konservitan naturon de la GA-signala vojo kaj la PFYRE-motivon trans angiospermoj, ĝi verŝajne estos transdonebla al aliaj specioj22. Konforme al tio, ekvivalenta mutacio en la riza SLR1 DELLA-proteino (HYY497AAA) ankaŭ montris subpremi la kreskorepresoran agadon de SLR1, dum nur iomete reduktante ĝian GA-mediaciitan degeneron, simile al mRGA23. Rimarkinde, lastatempaj studoj en Arabidopsis montris, ke ununura aminoacida mutacio en la PFYRE-domajno (S474L) ŝanĝis la transskriban agadon de RGA sen influi ĝian kapablon interagi kun transkripcifaktoraj partneroj50. Kvankam ĉi tiu mutacio estas tre proksima al la 3 aminoacidaj anstataŭigoj ĉeestantaj en mRGA, niaj studoj montras, ke ĉi tiuj du mutacioj ŝanĝas apartajn karakterizaĵojn de DELLA. Kvankam plej multaj transkripcifaktoraj partneroj ligas al la LHR1 kaj SAW-domajnoj de DELLA26,51, kelkaj konservitaj aminoacidoj en la PFYRE-domajno povas helpi stabiligi ĉi tiujn interagojn.
Internoda evoluo estas ŝlosila trajto en plantarkitekturo kaj plibonigo de rikolto. qmRGA rivelis pli altan GA-signaladan agadon en IPR-internodaj praĉeloj. Kombinante kvantan bildigon kaj genetikon, ni montris, ke GA-signalaj ŝablonoj supermetas cirklajn/transversajn ĉeldividiĝajn ebenojn en la SAM-epidermo, formante la ĉeldividiĝan organizon necesan por internoda evoluo. Pluraj reguliloj de la ĉeldividiĝa ebena orientiĝo estis identigitaj dum evoluo52,53. Nia laboro provizas klaran ekzemplon pri kiel GA-signala agado reguligas ĉi tiun ĉelan parametron. DELLA povas interagi kun antaŭfaldiĝantaj proteinaj kompleksoj41, do GA-signalado povas reguligi la ĉeldividiĝan ebenan orientiĝon per rekta influo de la kortikala mikrotubula orientiĝo40,41,54,55. Ni neatendite montris, ke en SAM, la korelacio de pli alta GA-signala agado ne estis ĉela plilongigo aŭ divido, sed nur kreska anizotropio, kio kongruas kun rekta efiko de GA sur la direkto de ĉeldividiĝo en la IPR. Tamen, ni ne povas ekskludi, ke ĉi tiu efiko povus ankaŭ esti nerekta, ekzemple mediaciita de GA-induktita ĉelmura moliĝo56. Ŝanĝoj en la ecoj de ĉelmuroj induktas mekanikan streson57,58, kiu ankaŭ povas influi la orientiĝon de la ĉeldividiĝa ebeno per influado de la orientiĝo de kortikaj mikrotubuloj39,46,59. La kombinitaj efikoj de GA-induktita mekanika streso kaj rekta reguligo de mikrotubula orientiĝo per GA eble partoprenas en la generado de specifa ŝablono de ĉeldividiĝa orientiĝo en la IPR por difini internodojn, kaj pliaj studoj estas necesaj por testi ĉi tiun ideon. Simile, antaŭaj studoj elstarigis la gravecon de la DELLA-interagantaj proteinoj TCP14 kaj 15 en la kontrolo de internoda formado60,61 kaj ĉi tiuj faktoroj eble mediacias la agon de GA kune kun BREVIPEDICELLUS (BP) kaj PENNYWISE (PNY), kiuj reguligas internodan disvolviĝon kaj montriĝis influi GA-signaladon2,62. Ĉar DELLA-oj interagas kun signalaj vojoj de brasinosteroidoj, etileno, jasmona acido kaj abscisa acido (ABA)63,64, kaj ke ĉi tiuj hormonoj povas influi la orientiĝon de la mikrotubuloj65, la efikoj de GA sur la orientiĝon de ĉeldividiĝo povas ankaŭ esti mediaciitaj de aliaj hormonoj.
Fruaj citologiaj studoj montris, ke kaj la internaj kaj la eksteraj regionoj de la Arabidopsis SAM estas necesaj por internoda disvolviĝo2,42. La fakto, ke GA aktive reguligas ĉeldividiĝon en la internaj histoj12, subtenas duoblan funkcion de GA en reguligo de meristemo kaj internoda grandeco en la SAM. La ŝablono de direkta ĉeldividiĝo ankaŭ estas strikte reguligita en la interna SAM-histo, kaj ĉi tiu reguligo estas esenca por tigokresko52. Estos interese ekzameni, ĉu GA ankaŭ ludas rolon en orientado de la ĉeldividiĝa ebeno en la interna SAM-organizado, tiel sinkronigante la specifon kaj disvolviĝon de internodoj ene de la SAM.
Plantoj estis kultivitaj *in vitro* en grundo aŭ 1x Murashige-Skoog (MS) medio (Duchefa) suplementita per 1% sakarozo kaj 1% agaragaro (Sigma) sub normaj kondiĉoj (16 horoj da lumo, 22 °C), krom eksperimentoj pri hipokotilo kaj radikokresko, en kiuj plantidoj estis kultivitaj sur vertikalaj platoj sub konstanta lumo kaj 22 °C. Por nitrataj eksperimentoj, plantoj estis kultivitaj sur modifita MS-medio (bioWORLD plant medium) suplementita per adekvata nitrato (0 aŭ 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-sukcinato, 1% sakarozo kaj 1% A-agaragaro (Sigma) sub longtagaj kondiĉoj.
GID1a cDNA enigita en pDONR221 estis rekombinita kun pDONR P4-P1R-pUBQ10 kaj pDONR P2R-P3-mCherry en pB7m34GW por generi pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA enigita en pDONR221 estis rekombinita en pB7RWG266 por generi p35S:IDD2-RFP. Por generi pGID1b::2xmTQ2-GID1b, 3,9 kb fragmento kontraŭflue de la GID1b-kodanta regiono kaj 4,7 kb fragmento enhavanta la GID1b-cDNA (1,3 kb) kaj finilon (3,4 kb) estis unue amplifitaj uzante la komencilojn en Aldona Tabelo 3 kaj poste enigitaj en pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) kaj pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektive, kaj fine rekombinitaj kun pDONR221 2xmTQ268 en la pGreen 012567 celan vektoron uzante Gateway-klonadon. Por generi pCUC2::LSSmOrange, la CUC2-reklamantosekvenco (3229 bp kontraŭflue de ATG) sekvata de la koda sekvenco de granda Stokes-ŝovita mOrange (LSSmOrange)69 kun la N7-nuklea lokaliza signalo kaj la NOS-transkripcia terminatoro estis kunmetitaj en la pGreen-kanamicinan celan vektoron uzante la Gateway 3-fragmentan rekombinigan sistemon (Invitrogen). La planta binara vektoro estis enkondukita en Agrobacterium tumefaciens-bakterion GV3101 kaj enkondukita en Nicotiana benthamiana-foliojn per la Agrobacterium-infiltrada metodo kaj en Arabidopsis thaliana per la flora trempa metodo, respektive. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry kaj pCLV3::mCherry-NLS qmRGA estis izolitaj de la F3- kaj F1-idoj de la respektivaj kruciĝoj, respektive.
RNA-hibridigo en situ estis efektivigita sur proksimume 1 cm longaj ŝospintoj72, kiuj estis kolektitaj kaj tuj fiksitaj en FAA-solvaĵo (3,7% formaldehido, 5% acetata acido, 50% etanolo) antaŭmalvarmigita ĝis 4 °C. Post 2 × 15-minutaj vakuaj traktadoj, la fiksativo estis ŝanĝita kaj la specimenoj estis inkubaciitaj dumnokte. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, kaj RGL3 cDNA-oj kaj kontraŭsencaj sondiloj al iliaj 3′-UTR-oj estis sintezitaj uzante la komencilojn montritajn en Aldona Tabelo 3 kiel priskribite de Rosier et al.73. Digoksigenin-markitaj sondiloj estis imunodetektitaj uzante digoksigenin-antikorpojn (3000-obla diluo; Roche, katalognumero: 11 093 274 910), kaj sekcioj estis makulitaj per solvaĵo de 5-bromo-4-kloro-3-indolilfosfato (BCIP, 250-obla diluo)/nitroblua tetrazolio (NBT, 200-obla diluo).
Afiŝtempo: 10-a de februaro 2025