Kresko de pafi apika meristemo (SAM) estas kritika por tigo-arkitekturo. Plantaj hormonojgiberelinoj(GAoj) ludas ŝlosilajn rolojn en kunordigado de plantkresko, sed ilia rolo en la SAM restas nebone komprenita. Ĉi tie, ni evoluigis ratiometrikan biosensilon de GA signalado per inĝenierado de la DELLA-proteino por subpremi ĝian esencan reguligan funkcion en la GA transskriba respondo konservante ĝian degeneron post GA-rekono. Ni pruvas, ke ĉi tiu biosensilo bazita en degradado precize registras ŝanĝojn en GA-niveloj kaj ĉela sentado dum disvolviĝo. Ni uzis ĉi tiun biosensilon por mapi GA-signalan aktivecon en la SAM. Ni montras, ke altaj GA-signaloj ĉeestas ĉefe en ĉeloj situantaj inter organaj primordioj, kiuj estas antaŭuloj al internodaj ĉeloj. Uzante alirojn de gajno- kaj perdo-de-funkcio, ni plue pruvas, ke GA reguligas la orientiĝon de la ĉeldivida ebeno, establante la kanonan ĉelan organizon de internodoj, tiel antaŭenigante internodspecifon en la SAM.
La ŝosa apika meristemo (SAM), situanta ĉe la ŝosapekso, enhavas niĉon de stamĉeloj kies agado generas flankajn organojn kaj tigajn nodojn en modula kaj ripeta maniero dum la vivo de la planto. Ĉiu el ĉi tiuj ripetaj unuoj, aŭ plantnodoj, inkluzivas internodojn kaj lateralajn organojn ĉe la nodoj, kaj aksemajn meristemojn en la foliaksoj1. La kresko kaj organizo de plantnodoj ŝanĝiĝas dum evoluo. En Arabidopsis, internodala kresko estas subpremita dum la vegeta stadio, kaj akselaj meristemoj restas neaktivaj en la akseloj de rozetfolioj. Dum la transiro al la flora fazo, la SAM iĝas la infloreska meristemo, generante longformajn internodojn kaj aksemajn burĝonojn, branĉetojn en la akseloj de kaŭlinaj folioj, kaj poste, senfoliajn florojn2. Kvankam ni faris signifan progreson en la kompreno de la mekanismoj kiuj kontrolas la inicon de folioj, floroj kaj branĉoj, relative malmulto estas konata pri kiel internodoj ekestas.
Kompreni la spatiotempan distribuadon de GA helpos pli bone kompreni la funkciojn de ĉi tiuj hormonoj en malsamaj histoj kaj en malsamaj evoluaj stadioj. Bildigo de la degenero de RGA-GFP-fuzio esprimita sub la ago de sia propra iniciatinto provizas gravajn informojn pri la reguligo de totalaj GA-niveloj en radikoj15,16. Tamen, RGA-esprimo varias trans histoj17 kaj estas reguligita fare de GA18. Tiel, diferenciga esprimo de la RGA-reklamanto povas rezultigi la fluoreskecpadronon observitan kun RGA-GFP kaj tiel ĉi tiu metodo ne estas kvanta. Pli lastatempe, bioaktiva fluoreskein (Fl)-etikedita GA19,20 rivelis la amasiĝon de GA en la radika endokortekso kaj la reguligon de ĝiaj ĉelaj niveloj per GA-transporto. Lastatempe, la GA FRET-sensilo nlsGPS1 montris, ke GA-niveloj korelacias kun ĉela plilongiĝo en radikoj, filamentoj kaj malhelkreskaj hipokotiloj21. Tamen, kiel ni vidis, GA-koncentriĝo ne estas la nura parametro kontrolanta GA-signalan agadon, ĉar ĝi dependas de kompleksaj sentaj procezoj. Ĉi tie, surbaze de nia kompreno pri la signalaj vojoj de DELLA kaj GA, ni raportas la disvolviĝon kaj karakterizadon de raciometria biosensilo bazita en degradado por signalado de GA. Por disvolvi ĉi tiun kvantan biosensilon, ni uzis mutaciulon GA-senteman RGA, kiu estis kunfandita al fluoreska proteino kaj ĉie esprimita en histoj, same kiel GA-sentema fluoreska proteino. Ni montras, ke la mutaciantaj RGA-proteinaj fuzioj ne malhelpas endogenan GA-signaladon kiam ĉiee esprimitaj, kaj ke ĉi tiu biosensilo povas kvantigi signalan agadon rezultantan el kaj GA-enigo kaj GA-signalpretigo de la sentaparataro kun alta spatiotempa rezolucio. Ni uzis ĉi tiun biosensilon por mapi la spatiotempan distribuon de GA-signala agado kaj kvantigi kiel GA reguligas ĉelan konduton en la SAM-epidermo. Ni pruvas, ke GA reguligas la orientiĝon de la divida ebeno de SAM-ĉeloj situantaj inter organaj primordioj, tiel difinante la kanonan ĉelan organizon de la internodo.
Fine, ni demandis ĉu qmRGA povus raporti ŝanĝojn en endogenaj GA-niveloj uzante kreskantajn hipokotilojn. Ni antaŭe montris, ke nitrato stimulas kreskon pliigante GA-sintezon kaj, siavice, DELLA34-degeneron. Sekve, ni observis, ke hipokotila longo en pUBQ10::qmRGA-plantidoj kreskigitaj sub abunda nitrato-provizo (10 mM NO3−) estis signife pli longa ol tiu en plantidoj kreskigitaj sub nitrato-mankaj kondiĉoj (Suplementa Fig. 6a). Konsekvence kun la kreskorespondo, GA-signaloj estis pli altaj en hipokotiloj de plantidoj kreskigitaj sub 10 mM NO3−-kondiĉoj ol en plantidoj kreskigitaj en foresto de nitrato (Suplementa Fig. 6b, c). Tiel, qmRGA ankaŭ ebligas monitoradon de ŝanĝoj en GA-signalado induktita per endogenaj ŝanĝoj en GA-koncentriĝo.
Por kompreni ĉu la GA signala agado detektita de qmRGA dependas de GA-koncentriĝo kaj GA-percepto, kiel atendite surbaze de la sensildezajno, ni analizis la esprimon de la tri GID1-riceviloj en vegetaj kaj reproduktaj histoj. En plantidoj, la raportlinio GID1-GUS montris, ke GID1a kaj c estis tre esprimitaj en kotiledonoj (Fig. 3a–c). Krome, ĉiuj tri riceviloj estis esprimitaj en folioj, flankaj radikprimordioj, radikpintoj (krom la radika ĉapo de GID1b), kaj la vaskula sistemo (Fig. 3a-c). En la infloresko SAM, ni detektis GUS-signalojn nur por GID1b kaj 1c (Suplementa Fig. 7a–c). Surloka hibridiĝo konfirmis ĉi tiujn esprimajn ŝablonojn kaj plue pruvis, ke GID1c estis unuforme esprimita ĉe malaltaj niveloj en la SAM, dum GID1b montris pli altan esprimon ĉe la periferio de la SAM (Suplementa Fig. 7d-l). La pGID1b::2xmTQ2-GID1b traduka kunfandiĝo ankaŭ malkaŝis gradigitan gamon de GID1b-esprimo, de malalta aŭ neniu esprimo en la centro de la SAM ĝis alta esprimo ĉe la organlimoj (Suplementa Fig. 7m). Tiel, GID1-receptoroj ne estas unuforme distribuitaj trans kaj ene de histoj. En postaj eksperimentoj, ni ankaŭ observis, ke superesprimo de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) pliigis la sentivecon de qmRGA en hipokotiloj al ekstera GA-apliko (Fig. 3d, e). Kontraste, fluoreskeco mezurita de qd17mRGA en la hipokotilo estis nesentema al GA3-traktado (Fig. 3f, g). Por ambaŭ provoj, plantidoj estis traktitaj kun altaj koncentriĝoj de GA (100 μM GA3) por taksi la rapidan konduton de la sensilo, kie la kapablo ligi al la GID1-receptoro estis plifortigita aŭ perdita. Kune, ĉi tiuj rezultoj konfirmas, ke la qmRGA-biosensilo servas kombinitan funkcion kiel GA kaj GA-sensilo, kaj sugestas, ke diferenciga esprimo de la GID1-receptoro povas signife moduli la emisivecon de la sensilo.
Ĝis nun, la distribuado de GA-signaloj en la SAM restas neklara. Tial ni uzis qmRGA-esprimantajn plantojn kaj la pCLV3::mCherry-NLS-stamĉel-raportiston35 por kalkuli alt-rezoluciajn kvantajn mapojn de GA-signal-agado, fokusante sur la L1-tavolo (epidermo; Fig. 4a, b, vidu Metodoj kaj Suplementaj Metodoj), ĉar L1-kontrolo de SAM rolas ŝlosilon de kresko en SAM3. Ĉi tie, pCLV3::mCherry-NLS-esprimo disponigis fiksan geometrian referencpunkton por analizi la spatiotempan distribuadon de GA-signala agado37. Kvankam GA estas konsiderata esenca por flanka organo-disvolviĝo4, ni observis, ke GA-signaloj estis malaltaj en la flora primordio (P) komencante de la P3-stadio (Fig. 4a, b), dum junaj P1 kaj P2 primordiums havis moderan aktivecon similan al tiu en la centra regiono (Fig. 4a, b). Pli alta GA signala agado estis detektita ĉe la organaj primordaj limoj, komencante ĉe P1 / P2 (ĉe la flankoj de la limo) kaj pintante ĉe P4, same kiel en ĉiuj ĉeloj de la ekstercentra regiono situanta inter la primordio (Fig. 4a, b kaj Suplementa Fig. 8a, b). Ĉi tiu pli alta signala aktiveco de GA estis observita ne nur en la epidermo, sed ankaŭ en la L2 kaj supraj L3-tavoloj (Suplementa Fig. 8b). La ŝablono de GA-signaloj detektitaj en la SAM uzante qmRGA ankaŭ restis senŝanĝa laŭlonge de la tempo (Suplementa Fig. 8c-f, k). Kvankam la qd17mRGA-konstruaĵo estis sisteme subreguligita en la SAM de T3-plantoj de kvin sendependaj linioj, kiujn ni detale karakterizis, ni povis analizi la fluoreskecajn ŝablonojn akiritajn per la pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruaĵo (Suplementa Fig. 8g–j, l). En ĉi tiu kontrollinio, nur malgrandaj ŝanĝoj en la fluoreskeca proporcio estis detektitaj en la SAM, sed en la SAM-centro ni observis klaran kaj neatenditan malkreskon en VENUS asociita kun TagBFP. Ĉi tio konfirmas, ke la signalpadrono observita de qmRGA reflektas GA-dependan degeneron de mRGA-VENUS, sed ankaŭ pruvas, ke qmRGA povas supertaksi GA-signalan agadon en la meristema centro. Resume, niaj rezultoj rivelas GA-signalan ŝablonon, kiu ĉefe reflektas la distribuadon de primordio. Ĉi tiu distribuo de la inter-prima regiono (IPR) ŝuldiĝas al la laŭgrada establado de alta GA signala agado inter la evoluanta primordio kaj la centra regiono, dum samtempe GA signala aktiveco en la primordio malpliiĝas (Fig. 4c, d).
La distribuado de GID1b kaj GID1c-receptoroj (vidu supre) indikas ke diferenciga esprimo de GA-receptoroj helpas formi la padronon de GA-signalagado en la SAM. Ni scivolis ĉu diferenca amasiĝo de GA povus esti implikita. Por esplori ĉi tiun eblecon, ni uzis la nlsGPS1 GA FRET-sensilo21. Pliigita aktiviga frekvenco estis detektita en la SAM de nlsGPS1 traktita kun 10 μM GA4 + 7 dum 100 min (Suplementa Fig. 9a-e), indikante, ke nlsGPS1 respondas al ŝanĝoj en GA-koncentriĝo en la SAM, kiel ĝi faras en radikoj21. Spaca distribuado de nlsGPS1-aktiviga ofteco malkaŝis relative malaltajn GA-nivelojn en la eksteraj tavoloj de la SAM, sed montris, ke ili estis levitaj en la centro kaj ĉe la limoj de la SAM (Fig. 4e kaj Suplementa Fig. 9a,c). Tio indikas ke GA ankaŭ estas distribuita en la SAM kun spaca padrono komparebla al tio rivelita fare de qmRGA. Kiel komplementa aliro, ni ankaŭ traktis la SAM per fluoreska GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) aŭ Fl sole kiel negativa kontrolo. La Fl-signalo estis distribuita tra la SAM, inkluzive de la centra regiono kaj primordio, kvankam je pli malalta intenseco (Fig. 4j kaj Suplementa Fig. 10d). Kontraste, ĉiuj tri GA-Fl akumuliĝis specife ene de la primordiaj limoj kaj je diversaj gradoj en la resto de la IPR, kun GA7-Fl akumuliĝanta en la plej granda domajno en la IPR (Fig. 4k kaj Suplementa Fig. 10a,b). Kvantigo de fluoreskeca intenseco malkaŝis, ke la IPR al ne-IPR-intenseco-proporcio estis pli alta en GA-Fl-traktita SAM kompare kun Fl-traktita SAM (Fig. 4l kaj Suplementa Fig. 10c). Kune, tiuj rezultoj indikas ke GA ĉeestas ĉe pli altaj koncentriĝoj en IPR-ĉeloj kiuj situas plej proksime al la organlimo. Tio indikas ke la padrono de SAM GA signala agado rezultas de kaj diferenciga esprimo de GA-receptoroj kaj diferenciga amasiĝo de GA en IPR-ĉeloj proksime de organlimoj. Tiel, nia analizo malkaŝis neatenditan spatiotempan ŝablonon de signalado de GA, kun pli malalta agado en la centro kaj primordio de la SAM kaj pli alta agado en la IPR en la ekstercentra regiono.
Por kompreni la rolon de diferenciga GA signala agado en la SAM, ni analizis la korelacion inter GA signala agado, ĉela ekspansio kaj ĉela divido uzante realtempan temp-rapidan bildigon de la SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Konsiderante la rolon de GA en kreskreguligo, oni atendis pozitivan korelacion kun ĉelaj vastiĝaj parametroj. Tial, ni unue komparis GA-signalajn agadmapojn kun mapoj de ĉela surfaca kreskorapideco (kiel prokurilo por la forto de ĉela ekspansio por antaŭfiksita ĉelo kaj por filinĉeloj ĉe divido) kaj kun mapoj de kreskanizotropio, kiu mezuras la direktecon de ĉela ekspansio (ankaŭ uzata ĉi tie por antaŭfiksita ĉelo kaj por filinaj ĉeloj ĉe divido; Fig. 5a,b, vidu Metodojn kaj Aldonaĵojn). Niaj mapoj de SAM-ĉela surfaca kreskorapideco estas kongruaj kun antaŭaj observoj38,39, kun minimumaj kreskorapidecoj ĉe la limo kaj maksimumaj kreskorapidecoj en evoluantaj floroj (Fig. 5a). Ĉefkomponenta analizo (PCA) montris, ke GA signala agado estis negative korelaciita kun ĉela surfaca kreskintenseco (Figuro 5c). Ni ankaŭ montris, ke la ĉefaj aksoj de variado, inkluzive de GA-signala enigo kaj kresko-intenso, estis ortaj al la direkto determinita de alta CLV3-esprimo, konfirmante la ekskludon de ĉeloj de la SAM-centro en la ceteraj analizoj. Spearman-korelanalizo konfirmis la PCA-rezultojn (Figuro 5d), indikante, ke pli altaj GA-signaloj en la IPR ne rezultigis pli altan ĉelan ekspansion. Tamen, korelacia analizo malkaŝis iomete pozitivan korelacion inter GA signala agado kaj kreskanizotropio (Figuro 5c, d), sugestante, ke pli alta GA signalado en la IPR influas la direkton de ĉela kresko kaj eble la pozicion de la ĉeldivida ebeno.
a, b Varmomapoj de averaĝa surfackresko (a) kaj kreskanizotropeco (b) en SAM averaĝis pli ol sep sendependaj plantoj (utiligitaj kiel anstataŭantoj por la forto kaj direkto de ĉela vastiĝo, respektive). c PCA-analizo inkludis la sekvajn variablojn: GA-signalo, surfaca kreskintenseco, surfaca kreskanizotropeco kaj CLV3-esprimo. PCA-komponento 1 estis ĉefe negative korelaciita kun surfaca kreskintenseco kaj pozitive korelaciita kun GA-signalo. PCA-komponento 2 estis plejparte pozitive korelaciita kun surfackreska anizotropio kaj negative korelaciita kun CLV3-esprimo. Procentoj reprezentas la variadon klarigitan de ĉiu komponanto. d Spearman korelacianalizo inter GA signalo, surfackreskintenseco, kaj surfackreskanizotropeco ĉe la histoskalo ekskludante CZ. La nombro dekstre estas la Spearman rho-valoro inter du variabloj. Asteriskoj indikas kazojn kie la korelacio/negativa korelacio estas tre signifa. e 3D bildigo de Col-0 SAM L1-ĉeloj per konfokusa mikroskopio. Novaj ĉelmuroj formitaj en la SAM (sed ne la primordio) je 10 h estas kolorigitaj laŭ siaj angulvaloroj. La kolorbreto estas montrita en la malsupra dekstra angulo. La enmetita montras la respondan 3D-bildon je 0 h. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj. f Skatolo-intrigoj montras ĉeldividajn indicojn en IPR kaj ne-IPR Col-0 SAM (n = 10 sendependaj plantoj). La centra linio montras la medianon, kaj la kestlimoj indikas la 25-a kaj 75-a procentoj. Barbo indikas la minimumajn kaj maksimumajn valorojn determinitajn per R-programaro. P-valoroj estis akiritaj per la duvosta t-testo de Welch. g, h Skema diagramo montranta (g) kiel mezuri la angulon de la nova ĉela muro (magento) kun respekto al la radiala direkto de la centro de la SAM (blanka punktlinio) (nur akutaj angulvaloroj, t.e., 0-90°, estas konsideritaj), kaj (h) la cirkonferencaj/flankaj kaj radialaj indikoj ene de la meristemo. i Frekvencaj histogramoj de ĉeldivida ebena orientiĝo trans la SAM (malhelblua), IPR (mezblua), kaj ne-IPR (helblua), respektive. P-valoroj estis akiritaj per duvosta Kolmogorov-Smirnov-testo. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj. j Frekvencaj histogramoj de ĉeldivida ebena orientiĝo de la IPR ĉirkaŭ P3 (helverda), P4 (meze verda), kaj P5 (malhelverda), respektive. P-valoroj estis akiritaj per duvosta Kolmogorov-Smirnov-testo. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj.
Sekve, ni poste esploris la korelacion inter GA-signalado kaj ĉela divido-agado identigante lastatempe formitajn ĉelmurojn dum la provo (Fig. 5e). Ĉi tiu aliro permesis al ni mezuri la frekvencon kaj direkton de ĉela divido. Surprize, ni trovis, ke la ofteco de ĉelaj dividoj en la IPR kaj la resto de la SAM (ne-IPR, Fig. 5f) estis simila, indikante, ke diferencoj en GA signalado inter IPR kaj ne-IPR-ĉeloj ne signife influas ĉelan dividon. Ĉi tio, kaj la pozitiva korelacio inter GA-signalado kaj kreskanizotropio, instigis nin pripensi ĉu GA-signal-agado povus influi la orientiĝon de la ĉeldivida ebeno. Ni mezuris la orientiĝon de la nova ĉela muro kiel akuta angulo rilate al la radiala akso konektanta la meristeman centron kaj la centron de la nova ĉela muro (Fig. 5e-i) kaj observis klaran tendencon por ĉeloj dividiĝi laŭ anguloj proksimaj al 90° rilate al la radiala akso, kun la plej altaj frekvencoj observitaj ĉe 70-80-28 %) (63.28 %) kaj 28. (Fig. 5e,i), responda al ĉelaj dividoj en la cirkonferenca/transversa direkto (Fig. 5h). Por ekzameni la kontribuon de GA-signalado al ĉi tiu ĉeldivida konduto, ni analizis ĉeldividajn parametrojn en la IPR kaj ne-IPR aparte (Fig. 5i). Ni observis, ke la divida angulo-distribuo en IPR-ĉeloj diferencis de tiu en ne-IPR-ĉeloj aŭ en ĉeloj en la tuta SAM, kun IPR-ĉeloj elmontrantaj pli altan proporcion de flankaj/cirklaj ĉelaj dividoj, te, 70-80° kaj 80-90° (33.86% kaj 30.71%, respektive, respondaj proporcioj) (Fig. 5i). Tiel, niaj observoj malkaŝis asocion inter alta GA signalado kaj ĉeldivida ebena orientiĝo proksima al la cirkumferenca direkto, simila al la korelacio inter GA signala agado kaj kreskanizotropio (Fig. 5c, d). Por plue establi la spacan konservadon de ĉi tiu asocio, ni mezuris la dividan ebenan orientiĝon en IPR-ĉeloj ĉirkaŭantaj la primordion komencante de P3, ĉar la plej alta GA signala agado estis detektita en ĉi tiu regiono ekde P4 (Fig. 4). La dividaj anguloj de la IPR ĉirkaŭ P3 kaj P4 montris neniujn statistike signifajn diferencojn, kvankam pliigita ofteco de flankaj ĉelaj dividoj estis observita en la IPR ĉirkaŭ P4 (Fig. 5j). Tamen, en la IPR-ĉeloj ĉirkaŭ P5, la diferenco en la orientiĝo de la ĉela divido-aviadilo fariĝis statistike signifa, kun akra pliiĝo en la ofteco de transversaj ĉelaj dividoj (Fig. 5j). Kune, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke GA-signalado povas kontroli la orientiĝon de ĉelaj dividoj en la SAM, kio kongruas kun antaŭaj raportoj40,41, ke alta GA-signalado povas indukti flankan orientiĝon de ĉelaj dividoj en la IPR.
Estas antaŭdirite ke ĉeloj en la IPR ne estos integrigitaj en primordia sed prefere en internodes2,42,43. La transversa orientiĝo de ĉeldividoj en la IPR povas rezultigi la tipan organizon de paralelaj longitudaj vicoj de epidermaj ĉeloj en internonudoj. Niaj observoj priskribitaj supre sugestas, ke GA-signalado verŝajne ludas rolon en ĉi tiu procezo per reguligo de la direkto de ĉela divido.
Perdo de funkcio de pluraj DELLA-genoj rezultigas konstitucian GA-respondon, kaj della mutaciuloj povas esti uzataj por testi ĉi tiun hipotezon44. Ni unue analizis la esprimpadronojn de kvin DELLA-genoj en la SAM. Transskriba fuzio de la GUS-linio45 malkaŝis, ke GAI, RGA, RGL1 kaj RGL2 (multe pli malgranda mezuro) estis esprimitaj en la SAM (Suplementa Fig. 11a–d). Surloka hibridiĝo plue pruvis, ke GAI-mRNA akumuliĝas specife en primordioj kaj evoluantaj floroj (Suplementa Fig. 11e). RGL1 kaj RGL3-mRNA estis detektitaj tra la SAM-kanopeo kaj en pli malnovaj floroj, dum RGL2-mRNA estis pli abunda en la landlima regiono (Suplementa Fig. 11f-h). Konfoka bildigo de pRGL3::RGL3-GFP SAM konfirmis la esprimon observitan per surloka hibridiĝo kaj montris, ke RGL3-proteino akumuliĝas en la centra parto de la SAM (Suplementa Fig. 11i). Uzante la pRGA::GFP-RGA-linion, ni ankaŭ trovis, ke RGA-proteino akumuliĝas en la SAM, sed ĝia abundo malpliiĝas ĉe la limo ekde P4 (Suplementa Fig. 11j). Precipe, la esprimaj ŝablonoj de RGL3 kaj RGA estas kongruaj kun pli alta GA signala agado en la IPR, kiel detektita de qmRGA (Fig. 4). Krome, ĉi tiuj datumoj indikas, ke ĉiuj DELLA-oj estas esprimitaj en la SAM kaj ke ilia esprimo kolektive ampleksas la tutan SAM.
Ni poste analizis la ĉeldividajn parametrojn en la sovaĝa tipo SAM (Ler, kontrolo) kaj la gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 de la kvinopaj (tutmondaj) mutaciuloj (Fig. 6a, b). Interese, ni observis statistike signifan ŝanĝon en la distribuado de ĉeldividaj angulaj frekvencoj en la tutmonda mutanto SAM kompare kun la sovaĝa tipo (Fig. 6c). Ĉi tiu ŝanĝo en la tutmonda mutanto estis pro pliiĝo en la ofteco de 80-90° anguloj (34.71% kontraŭ 24.55%) kaj, en pli malgranda mezuro, 70-80° anguloj (23.78% kontraŭ 20.18%), t.e., responda al transversaj ĉelaj dividoj (Fig. 6c). La ofteco de ne-transversaj dividoj (0–60°) ankaŭ estis pli malalta en la tutmonda mutanto (Fig. 6c). La ofteco de transversaj ĉelaj dividoj estis signife pliigita en la SAM de la tutmonda mutanto (Fig. 6b). La ofteco de transversaj ĉelaj dividoj en la IPR ankaŭ estis pli alta en la tutmonda mutanto kompare kun la sovaĝa tipo (Fig. 6d). Ekster la IPR-regiono, la sovaĝa tipo havis pli unuforman distribuadon de ĉeldividaj anguloj, dum la della tutmonda mutaciulo preferis tanĝantajn dividojn kiel la IPR (Fig. 6e). Ni ankaŭ kvantigis la orientiĝon de ĉelaj dividoj en la SAM de ga2-oksidazo (ga2ox) kvinoblaj mutaciuloj (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 kaj ga2ox6-2), GA-neaktiva mutaciulfono en kiu GA akumuliĝas. Konsekvence kun la pliiĝo de GA-niveloj, la SAM de la kvinobla ga2ox-mutacianta infloresko estis pli granda ol tiu de Col-0 (Suplementa Fig. 12a, b), kaj kompare kun Col-0, la kvinobla ga2ox SAM montris klare malsaman distribuadon de ĉelaj dividaj anguloj, kun la angula frekvenco pliiĝanta de 50° al dividaj divizioj denove pliiĝantaj de 50° al 90°. Fig. 12a–c). Tiel, ni montras, ke konstitua aktivigo de GA-signalado kaj GA-amasiĝo induktas flankajn ĉeldividojn en la IPR kaj la resto de la SAM.
a, b 3D bildigo de la L1-tavolo de PI-makulita Ler (a) kaj tutmonda della mutant (b) SAM uzante konfokusan mikroskopion. Novaj ĉelaj muroj formitaj en la SAM (sed ne la primordio) dum 10-h periodo estas montritaj kaj kolorigitaj laŭ siaj angulvaloroj. La enmetita montras la SAM je 0 h. La kolorbreto estas montrata en la malsupra dekstra angulo. La sago en (b) montras al ekzemplo de vicigitaj ĉeldosieroj en la tutmonda della mutanto. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj. ce komparo de la frekvencdistribuo de ĉeldividaj aviadilorientiĝoj en la tuta SAM (d), IPR (e), kaj ne-IPR (f) inter Ler kaj tutmonda della. P-valoroj estis akiritaj per duvosta Kolmogorov-Smirnov-testo. f, g 3D bildigo de konfokusaj bildoj de PI-makula SAM de Col-0 (i) kaj pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenaj plantoj. Paneloj (a, b) montras novajn ĉelmurojn (sed ne primordiojn) formitajn en la SAM ene de 10 h. La eksperimento estis ripetita dufoje kun similaj rezultoj. h–j Komparo de la frekvenca distribuo de ĉeldividaj aviadilorientiĝoj situantaj en la tuta SAM (h), IPR (i) kaj ne-IPR (j) inter Col-0 kaj pCUC2::gai-1-VENUS-plantoj. P-valoroj estis akiritaj per duvosta Kolmogorov-Smirnov-testo.
Ni poste testis la efikon de malhelpado de GA-signalado specife en la IPR. Tiucele, ni uzis la reklamilon de kotiledona taso 2 (CUC2) por movi esprimon de reganta negativa gai-1-proteino kunfandita al VENUS (en la linio pCUC2::gai-1-VENUS). En la sovaĝ-speca SAM, la CUC2-reklamanto movas esprimon de la plej multaj IPRoj en la SAM, inkluzive de limĉeloj, de P4 pluen, kaj simila specifa esprimo estis observita en pCUC2::gai-1-VENUS-plantoj (vidu malsupre). La distribuado de ĉeldividaj anguloj tra la SAM aŭ IPR de pCUC2::gai-1-VENUS-plantoj ne estis signife malsama al tiu de la sovaĝa tipo, kvankam neatendite ni trovis, ke ĉeloj sen IPR en ĉi tiuj plantoj dividiĝis je pli alta ofteco de 80-90° (Fig. 6f-j).
Estis sugestite ke la direkto de ĉela divido dependas de la geometrio de la SAM, aparte la streĉa streĉo generita de la histokurbeco46. Ni do demandis ĉu la formo de la SAM estis ŝanĝita en la della tutmonda mutaciulo kaj pCUC2::gai-1-VENUS-plantoj. Kiel raportite antaŭe12, la grandeco de la tutmonda mutaciulo SAM estis pli granda ol tiu de la sovaĝa tipo (Suplementa Fig. 13a, b, d). Surloka hibridiĝo de CLV3 kaj STM RNA konfirmis la meristeman ekspansion en della mutaciuloj kaj plue montris la flankan ekspansion de la stamĉela niĉo (Suplementa Fig. 13e, f, h, i). Tamen, la SAM-kurbeco estis simila en ambaŭ genotipoj (Suplementa Fig. 13k, m, n, p). Ni observis similan kreskon de grandeco en la gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della kvarobla mutaciulo sen ŝanĝo de kurbeco kompare kun la sovaĝa tipo (Suplementa Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). La ofteco de ĉeldivida orientiĝo ankaŭ estis tuŝita en la kvarobla mutaciulo, sed en pli malgranda mezuro ol en la monolita mutaciulo (Suplementa Fig. 12d-f). Tiu dozefiko, kune kun la manko de efiko al kurbeco, indikas ke resta RGL3-agado en la Della kvarobla mutaciulo limigas ŝanĝojn en ĉeldividiĝorientiĝo kaŭzitaj de perdo de DELLA-agado kaj ke ŝanĝoj en lateralaj ĉeldividoj okazas en respondo al ŝanĝoj en GA signalanta agado prefere ol ŝanĝoj en SAM-geometrio. Kiel priskribite supre, la CUC2-reklamanto kondukas IPR-esprimon en la SAM komencante ĉe P4 (Suplementa Fig. 14a, b), kaj kontraste, la pCUC2::gai-1-VENUS SAM havis reduktitan grandecon sed pli altan kurbecon (Suplementa Fig. 14c-h). Ĉi tiu ŝanĝo en pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologio povas rezultigi malsaman distribuadon de mekanikaj stresoj kompare kun la sovaĝa tipo, en kiu altaj cirkonferencaj stresoj komenciĝas je pli mallonga distanco de la SAM-centro47. Alternative, la ŝanĝoj en pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologio povas rezulti el ŝanĝoj en regionaj mekanikaj trajtoj induktitaj per transgenesprimo48. En ambaŭ kazoj, ĉi tio povus parte kompensi la efikojn de ŝanĝoj en signalado de GA pliigante la verŝajnecon, ke ĉeloj dividiĝos en la cirkonferenca/transversa orientiĝo, klarigante niajn observojn.
Kunigitaj, niaj datumoj konfirmas, ke pli alta GA-signalado ludas aktivan rolon en la flanka orientiĝo de la ĉeldivida aviadilo en la IPR. Ili ankaŭ montras ke meristema kurbiĝo ankaŭ influas la orientiĝon de la ĉeldividadaviadilo en la IPR.
La transversa orientiĝo de la dividadaviadilo en la IPR, pro alta GA signalanta agado, sugestas ke GA antaŭ-organizas radialĉelan dosieron en la epidermo ene de la SAM por difini la ĉelan organizon kiu poste estos trovita en la epiderma internodo. Efektive, tiaj ĉelaj dosieroj estis ofte videblaj en SAM-bildoj de della tutmondaj mutaciuloj (Fig. 6b). Tiel, por plu esplori la evoluan funkcion de la spaca padrono de GA-signalado en la SAM, ni uzis temp-rapidan bildigon por analizi la spacan organizon de ĉeloj en la IPR en sovaĝa tipo (Ler kaj Col-0), della tutmondaj mutaciuloj kaj pCUC2::gai-1-VENUS transgenaj plantoj.
Ni trovis, ke qmRGA montris, ke GA signala agado en la IPR pliiĝis de P1 / P2 kaj pintis ĉe P4, kaj ĉi tiu ŝablono restis konstanta laŭlonge de la tempo (Fig. 4a–f kaj Suplementa Fig. 8c–f, k). Por analizi la spacan organizon de ĉeloj en la IPR kun kreskanta GA-signalo, ni etikedis Ler IPR-ĉelojn supre kaj al la flankoj de P4 laŭ ilia evolua sorto analizita 34 h post unua observado, t.e., pli ol du plastidaj tempoj, permesante al ni sekvi IPR-ĉelojn dum primordia evoluo de P1/P2 ĝis P4. Ni uzis tri malsamajn kolorojn: flava por tiuj ĉeloj, kiuj estis integritaj en la primordio proksime de P4, verda por tiuj, kiuj estis en la IPR, kaj purpura por tiuj, kiuj partoprenis ambaŭ procezojn (Fig. 7a-c). Je t0 (0 h), 1-2 tavoloj de IPR-ĉeloj estis videblaj antaŭ P4 (Fig. 7a). Kiel atendite, kiam ĉi tiuj ĉeloj dividiĝis, ili faris tion ĉefe per la transversa divida ebeno (Fig. 7a–c). Similaj rezultoj estis akiritaj uzante Col-0 SAM (fokusante sur P3, kies limo faldas simile al P4 en Ler), kvankam en ĉi tiu genotipo la faldo formita ĉe la flora limo kaŝis la IPR-ĉelojn pli rapide (Fig. 7g–i). Tiel, la dividadpadrono de IPR-ĉeloj antaŭ-organizas la ĉelojn en radialaj vicoj, kiel en internodoj. La organizo de radialaj vicoj kaj la lokalizo de IPR-ĉeloj inter sinsekvaj organoj indikas ke tiuj ĉeloj estas internodalaj prapatroj.
Ĉi tie, ni evoluigis ratiometrikan GA-signalan biosensilon, qmRGA, kiu permesas kvantan mapadon de GA-signala agado rezultanta el kombinitaj GA kaj GA-receptorkoncentriĝoj minimumigante interferon kun endogenaj signalaj vojoj, tiel provizante informojn pri GA-funkcio ĉe la ĉela nivelo. Tiucele ni konstruis modifitan DELLA-proteinon, mRGA, kiu perdis la kapablon ligi DELLA-interagajn partnerojn sed restas sentema al GA-induktita proteolizo. qmRGA respondas al kaj eksogenaj kaj endogenaj ŝanĝoj en GA-niveloj, kaj ĝiaj dinamikaj sentaj trajtoj ebligas taksadon de spatiotempaj ŝanĝoj en GA-signalagado dum evoluo. qmRGA ankaŭ estas tre fleksebla ilo ĉar ĝi povas esti adaptita al malsamaj histoj ŝanĝante la reklamanton uzitan por sia esprimo (se necese), kaj donita la konservitan naturon de la GA signalpado kaj la PFYRE-ĉeftemo trans angiospermoj, ĝi verŝajne estos transdonebla al aliaj specioj22. Konsekvence kun tio, ekvivalenta mutacio en la rizo SLR1 DELLA-proteino (HYY497AAA) ankaŭ pruviĝis subpremi la kreskrepremilan agadon de SLR1 dum nur iomete reduktante sian GA-mediaciitan degeneron, simile al mRGA23. Precipe, lastatempaj studoj en Arabidopsis montris ke ununura aminoacida mutacio en la PFYRE-domajno (S474L) ŝanĝis la transskriban agadon de RGA sen influi ĝian kapablon interagi kun transkripcifaktorpartneroj50. Kvankam ĉi tiu mutacio estas tre proksima al la 3 aminoacidaj anstataŭoj ĉeestantaj en mRGA, niaj studoj montras, ke ĉi tiuj du mutacioj ŝanĝas apartajn trajtojn de DELLA. Kvankam la plej multaj transkripcifaktorpartneroj ligas al la LHR1 kaj SAW-domajnoj de DELLA26,51, kelkaj konservitaj aminoacidoj en la PFYRE-domajno povas helpi stabiligi tiujn interagojn.
Internoda evoluo estas ŝlosila trajto en plantarkitekturo kaj rendimentoplibonigo. qmRGA rivelis pli altan GA-signalan aktivecon en IPR-internadaj praĉeloj. Kombinante kvantan bildigon kaj genetikon, ni montris, ke GA-signalaj ŝablonoj supermetas cirkulajn/transversajn ĉeldividajn ebenojn en la SAM-epidermo, formante la ĉeldividan organizon necesan por internodisvolviĝo. Pluraj reguligistoj de ĉeldivida ebena orientiĝo estis identigitaj dum evoluo52,53. Nia laboro provizas klaran ekzemplon pri kiel GA signala agado reguligas ĉi tiun ĉelan parametron. DELLA povas interagi kun antaŭfaldaj proteinkompleksoj41, do GA-signalado povas reguligi ĉeldividan ebenan orientiĝon rekte influante kortikalan mikrotubulorientiĝon40,41,54,55. Ni neatendite montris, ke en SAM, la korelacio de pli alta GA signala agado ne estis ĉela plilongiĝo aŭ divido, sed nur kreskanizotropeco, kiu kongruas kun rekta efiko de GA sur la direkto de ĉela divido en la IPR. Tamen, ni ne povas ekskludi, ke ĉi tiu efiko ankaŭ povus esti nerekta, ekzemple mediata de GA-induktita ĉelmuro moliĝo56. Ŝanĝoj en ĉelaj murecoj induktas mekanikan streson57,58, kiu ankaŭ povas influi la orientiĝon de la ĉeldivida ebeno influante la orientiĝon de kortikalaj mikrotuboj39,46,59. La kombinitaj efikoj de GA-induktita mekanika streso kaj rekta reguligo de mikrotubulorientiĝo de GA povas esti implikitaj en generado de specifa padrono de ĉeldividiĝo-orientiĝo en la IPR por difini internodojn, kaj pliaj studoj estas necesaj por testi ĉi tiun ideon. Simile, antaŭaj studoj elstarigis la gravecon de la DELLA-interagaj proteinoj TCP14 kaj 15 en la kontrolo de internodoformado60,61 kaj ĉi tiuj faktoroj povas mediacii la agadon de GA kune kun BREVIPEDICELLUS (BP) kaj PENNYWISE (PNY), kiuj reguligas internodevoluon kaj pruviĝis influas GA signaladon2,62. Konsiderante ke DELLA-oj interagas kun brasinosteroido, etileno, jasmona acido kaj abscisacido (ABA) signalaj vojoj63,64 kaj ke tiuj hormonoj povas influi mikrotubulorientiĝon65, la efikoj de GA sur ĉeldividiĝo-orientiĝo ankaŭ povas esti mediaciitaj per aliaj hormonoj.
Fruaj citologiaj studoj montris ke kaj la internaj kaj eksteraj regionoj de la Arabidopsis SAM estas postulataj por internodevoluo2,42. La fakto ke GA aktive reguligas ĉeldividon en la internaj histoj12 subtenas duoblan funkcion de GA en reguligado de meristemo kaj internodgrandeco en la SAM. La padrono de direkta ĉeldividiĝo ankaŭ estas malloze reguligita en la interna SAM-histo, kaj tiu reguligo estas esenca por tigokresko52. Estos interese ekzameni ĉu GA ankaŭ ludas rolon en orientiĝo de la ĉeldividadaviadilo en la interna SAM-organizo, tiel sinkronigante la specifon kaj evoluon de internodoj ene de la SAM.
Plantoj estis kultivitaj in vitro en grundo aŭ 1x Murashige-Skoog (MS) mezo (Duchefa) kompletigita kun 1% sakarozo kaj 1% agaro (Sigma) sub normaj kondiĉoj (16 h lumo, 22 °C), krom por hipokotilo kaj radikkreskeksperimentoj en kiuj plantidoj estis kultivitaj sur vertikalaj platoj sub konstanta lumo kaj 22 °C. Por nitrato-eksperimentoj, plantoj estis kultivitaj sur modifita MS-medio (bioWORLD plantmedio) kompletigita kun adekvata nitrato (0 aŭ 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinato, 1% sakarozo kaj 1% A-agaro (Sigma) sub longaj kondiĉoj.
GID1a cDNA enigita en pDONR221 estis rekombinita kun pDONR P4-P1R-pUBQ10 kaj pDONR P2R-P3-mCherry en pB7m34GW por generi pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA enigita en pDONR221 estis rekombinita en pB7RWG266 por generi p35S:IDD2-RFP. Por generi pGID1b::2xmTQ2-GID1b, 3.9 kb-fragmento kontraŭflue de la GID1b-kodregiono kaj 4.7 kb fragmento enhavanta la GID1b cDNA (1.3 kb) kaj terminatoro (3.4 kb) unue estis plifortigitaj uzante la enkondukojn en Suplementa Tabelo en PDON 3 kaj poste PR4-enigitan Fiŝon p1R Scientific) kaj pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektive, kaj finfine rekombinite kun pDONR221 2xmTQ268 en la pGreen 012567 celvektoron uzante Gateway-klonadon. Por generi pCUC2::LSSmOrange, la CUC2-reklamantsekvenco (3229 bp kontraŭflue de ATG) sekvita per la kodiga sekvenco de granda Stokes-ŝanĝita mOrange (LSSmOrange)69 kun la N7 nuklea lokalizsignalo kaj la NOS-transskriba terminatoro estis kunvenita en la pGreen-an celsistemon de rekombinaĵo-kanamicin-vektoro uzante la pGreen-kanamicin-rekombinigan sistemon. (Invitrogeno). La planta binara vektoro estis enkondukita en Agrobacterium tumefaciens-trostreĉiĝo GV3101 kaj enkondukita en Nicotiana benthamiana folioj per Agrobacterium-infiltradmetodo kaj en Arabidopsis thaliana Col-0 per flora trempmetodo, respektive. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry kaj pCLV3::mCherry-NLS qmRGA estis izolitaj de la F3 kaj F1 epigonoj de la respektivaj krucoj, respektive.
RNA surloke hibridiĝo estis farita sur ĉirkaŭ 1 cm longaj ŝospintoj72, kiuj estis kolektitaj kaj tuj fiksitaj en FAA-solvo (3.7% formaldehido, 5% acetacido, 50% etanolo) antaŭmalvarmigita al 4 °C. Post 2 × 15-minutaj vakuaj traktadoj, la fiksilo estis ŝanĝita kaj specimenoj estis kovataj dum la nokto. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, kaj RGL3 cDNAs kaj kontraŭsensaj enketoj al siaj 3′-UTRs estis sintezitaj uzante la enkondukojn montritajn en Suplementa Tabelo 3 kiel priskribite de Rosier et al.73. Digoxigenin-etikeditaj enketoj estis imunodetektitaj uzante digoksigeninantikorpojn (3000-obla diluo; Roche, katalognombro: 11 093 274 910), kaj sekcioj estis makulitaj per 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfato (BCIP, 250-NBIP, 250-274 910). 200-obla diluo) solvo.
Afiŝtempo: Feb-10-2025