La kontraŭverma drogo N,N-dietil-m-toluamido (DEET) laŭ raportoj inhibicias AChE (acetilkolinesterazon) kaj havas eblajn kancerigajn ecojn pro troa vaskulariĝo. En ĉi tiu artikolo, ni montras, ke DEET specife stimulas endotelajn ĉelojn, kiuj antaŭenigas angiogenezon, tiel pliigante tumorkreskon. DEET aktivigas ĉelajn procezojn kondukantajn al angiogenezo, inkluzive de proliferado, migrado kaj adhero. Ĉi tio estas asociita kun pliigita NO-produktado kaj VEGF-esprimo en endotelaj ĉeloj. Silentigo de M3 aŭ uzado de farmakologiaj M3-inhibiciiloj aboliciis ĉiujn ĉi tiujn efikojn, sugestante, ke DEET-induktita angiogenezo estas M3-sentema. Eksperimentoj implikantaj kalcian signaladon en endotelaj kaj HEK-ĉeloj troesprimantaj M3-receptorojn, same kiel ligaj kaj aldokiĝaj studoj, indikas, ke DEET agas kiel alostera modulatoro de M3-receptoroj. Krome, DEET inhibicias AChE, tiel pliigante la biohaveblecon de acetilkolino kaj ĝian ligadon al M3-receptoroj, kaj pliigante proangiogenajn efikojn per alostera reguligo.
Primaraj endokrinaj ĉeloj (EC) estis izolitaj el la aorto de svisaj musoj. La ekstrakta metodo estis adaptita de la Kobayashi-protokolo 26. Musaj EC estis kultivitaj en EBM-2-medio suplementita per 5% varmo-inaktivigita FBS ĝis la kvara trairejo.
La efiko de du koncentriĝoj de DEET sur la proliferadon de HUVEC, U87MG, aŭ BF16F10 estis analizita uzante la CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Mallonge, 5.10³ ĉeloj po puto estis semitaj en 96-puta plato, lasitaj alkroĉiĝi dumnokte, kaj poste traktitaj per DEET dum 24 horoj. Post forigo de la kreskomedio, aldonu tinktur-ligan solvaĵon al ĉiu puto de la mikroplato kaj kovu la ĉelojn je 37 °C dum 30 minutoj. Fluoreskaj niveloj estis determinitaj uzante Mithras LB940 plurmodilan mikroplatlegilon (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germanio) ekipitan per 485 nm ekscitaj filtriloj kaj 530 nm emisiaj filtriloj.
HUVEC-oj estis semitaj en 96-putaj platoj je denseco de 10⁴ ĉeloj po puto. Ĉeloj estis traktitaj per DEET dum 24 horoj. Ĉelvivebleco estis taksita per kolorimetria MTT-analizo (Sigma-Aldrich, M5655). Optikaj densecaj valoroj estis akiritaj per plurmodula mikroplatlegilo (Mithras LB940) je ondolongo de 570 nm.
La efikoj de DEET estis studitaj per *in vitro* angiogenezaj analizoj. Traktado per 10⁻⁸ M aŭ 10⁻⁵ M DEET pliigis la formadon de kapilara longo en HUVEC-oj (Fig. 1a, b, blankaj stangoj). Kompare kun la kontrolgrupo, traktado per DEET-koncentriĝoj variantaj de 10⁻⁴ ĝis 10⁻⁵ M montris, ke la kapilara longo atingis plateaŭon je 10⁻⁸ M DEET (Aldona Fig. S2). Neniu signifa diferenco estis trovita en la *in vitro* proangiogena efiko de HUVEC-oj traktitaj per DEET en la koncentriĝa intervalo de 10⁻⁸ M kaj 10⁻⁵ M.
Por determini la efikon de DEET sur neovaskularigo, ni faris studojn pri neovaskularigo *in vivo*. Post 14 tagoj, musoj injektitaj per endotelaj ĉeloj antaŭkultivitaj per 10⁻⁸ M aŭ 10⁻⁵ M DEET montris signifan pliiĝon en la enhavo de hemoglobino (Fig. 1c, blankaj stangoj).
Krome, DEET-induktita neovaskulariĝo estis studita en U87MG ksenograft-portantaj musoj, kiuj estis injektitaj ĉiutage (ip) per DEET je dozo konata induktanta plasmokoncentriĝojn de 10⁻⁵ M, kio estas normala ĉe eksponitaj homoj. en 23. Detekteblaj tumoroj (t.e. tumoroj >100 mm³) estis observitaj 14 tagojn post injekto de U87MG-ĉeloj en musojn. Je la 28-a tago, la tumorkresko estis signife plifortigita en DEET-traktitaj musoj kompare kun kontrolmusoj (Fig. 1d, kvadratoj). Krome, CD31-kolorigo de tumoroj montris, ke DEET signife pliigis kapilaran areon sed ne mikrovaskulan densecon. (Fig. 1e–g).
Por determini la rolon de muskarinaj receptoroj en DETA-induktita proliferado, 10⁻⁸ M aŭ 10⁻⁵ M DETA en ĉeesto de pFHHSiD (10⁻⁷ M, selektema M3-receptora antagonisto) estis uzata. Traktado de HUVEC. pFHHSiD tute blokis la proliferadajn ecojn de DETA ĉe ĉiuj koncentriĝoj (Tabelo 1).
Sub ĉi tiuj kondiĉoj, ni ankaŭ ekzamenis ĉu DEET pliigus kapilaran longon en HUVEC-ĉeloj. Simile, pFHHSiD signife malhelpis DEET-induktitan kapilaran longon (Fig. 1a, b, grizaj stangoj). Plue, similaj eksperimentoj estis faritaj kun M3 siRNA. Kvankam la kontrola siRNA ne estis efika en antaŭenigado de kapilara formado, silentigo de la M3-muskarina receptoro aboliciis la kapablon de DEET pliigi kapilaran longon (Fig. 1a, b, nigraj stangoj).
Krome, kaj 10-8 M aŭ 10-5 M DEET-induktita vaskulariĝo in vitro kaj neovaskulariĝo in vivo estis tute blokitaj de pFHHSiD (Fig. 1c, d, cirkloj). Ĉi tiuj rezultoj indikas, ke DEET antaŭenigas angiogenezon tra vojo sentema al selektemaj M3-receptoraj antagonistoj aŭ M3-siRNA.
AChE estas la molekula celo de DEET. Medikamentoj kiel donepezilo, kiuj agas kiel AChE-inhibiciiloj, povas stimuli endotelan ĉelan ĉel-angiogenezon in vitro kaj en musaj malantaŭkruraj iskemiaj modeloj14. Ni testis la efikon de du koncentriĝoj de DEET sur la AChE-enziman aktivecon en HUVEC. Malaltaj (10-8 M) kaj altaj (10-5 M) koncentriĝoj de DEET malpliigis endotelan AChE-aktivecon kompare kun kontrolkondiĉoj (Fig. 2).
Ambaŭ koncentriĝoj de DEET (10⁻⁸ M kaj 10⁻⁵ M) reduktis acetilkolinesterazan aktivecon sur HUVEC. BW284c51 (10⁻⁵ M) estis uzata kiel kontrolo por acetilkolinesterazaj inhibitoroj. Rezultoj estas esprimitaj kiel procento de AChE-aktiveco sur HUVEC traktitaj per la du koncentriĝoj de DEET kompare kun ĉeloj traktitaj per vehiklo. Valoroj estas esprimitaj kiel meznombro ± SEM de ses sendependaj eksperimentoj. *p < 0,05 kompare kun kontrolo (testo de multkompara testo de Kruskal-Wallis kaj Dunn).
Nitrogena oksido (NO) partoprenas en la angiogeneza procezo 33, tial oni studis NO-produktadon en DEET-stimulitaj HUVEC-oj. DEET-traktita endotela NO-produktado estis pliigita kompare kun kontrolĉeloj, sed atingis signifon nur je dozo de 10-8 M (Fig. 3c). Por determini la molekulajn ŝanĝojn kontrolantajn DEET-induktitan NO-produktadon, eNOS-esprimo kaj aktivigo estis analizitaj per okcidenta makulumado. Kvankam DEET-traktado ne ŝanĝis eNOS-esprimon, ĝi signife pliigis eNOS-fosforiligon ĉe ĝia aktiviga loko (Ser-1177) dum malpliigis ĝian inhibician lokon (Thr-495) kompare kun netraktitaj ĉeloj en eNOS-fosforiligo (Fig. 3d). Krome, la proporcio de fosforiligita eNOS ĉe la aktiviga loko kaj inhibicia loko estis kalkulita post normaligo de la kvanto de fosforiligita eNOS al la totala kvanto de enzimo. Ĉi tiu proporcio estis signife pliigita en HUVEC-oj traktitaj kun ĉiu koncentriĝo de DEET kompare kun netraktitaj ĉeloj (Fig. 3d).
Fine, la esprimo de VEGF, unu el la ĉefaj proangiogenezaj faktoroj, estis analizita per okcidenta makulumado. DEET signife pliigis VEGF-esprimon, dum pFHHSiD tute blokis ĉi tiun esprimon.
Ĉar la efikoj de DEET estas sentemaj kaj al farmakologia blokado kaj al malsuprenregulado de M3-receptoroj, ni testis la hipotezon, ke DEET eble plifortigas kalcian signaladon. Surprize, DEET ne sukcesis pliigi citoplasman kalcion en HUVEC (datumoj ne montritaj) kaj HEK/M3 (Fig. 4a, b) por ambaŭ uzitaj koncentriĝoj.
Afiŝtempo: 30-a de decembro 2024