La kontraŭhelminta drogo N,N-dietil-m-toluamido (DEET) estis raportita inhibicii AChE (acetilkolinesterazo) kaj havas eblajn karcinogenajn trajtojn pro troa vaskularigo. En ĉi tiu artikolo, ni montras, ke DEET specife stimulas endoteliajn ĉelojn, kiuj antaŭenigas angiogenezon, tiel pliigante tumoran kreskon. DEET aktivigas ĉelajn procezojn kondukantajn al angiogenezo, inkluzive de proliferado, migrado kaj adhero. Tio estas rilata al pliigita NO-produktado kaj VEGF-esprimo en endoteliaj ĉeloj. Silentigo de M3 aŭ uzado de farmakologiaj M3-inhibitoroj aboliciis ĉiujn tiujn efikojn, sugestante ke DEET-induktita angiogenezo estas M3-sentema. Eksperimentoj implikantaj kalcian signaladon en endotelaj kaj HEK-ĉeloj troesprimante M3-receptorojn, same kiel ligadon kaj aldokiĝantajn studojn, indikas ke DEET funkcias kiel alostera modulatoro de M3-receptoroj. Krome, DEET malhelpas AChE, tiel pliigante la biohaveblecon de acetilkolino kaj ĝian ligon al M3-receptoroj, kaj plibonigante proangiogenajn efikojn per alostera reguligo.
Primaraj ECs estis izolitaj de la aorto de svisaj musoj. La eltira metodo estis adaptita de la Kobayashi-protokolo 26 . Murine EC-oj estis kultivitaj en EBM-2-medio kompletigita kun 5% varmo-senaktivigita FBS ĝis la kvara trairejo.
La efiko de du koncentriĝoj de DEET sur la proliferado de HUVEC, U87MG aŭ BF16F10 estis analizita uzante la CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molekulaj Sondoj, C7026). Mallonge, 5.103 ĉeloj per puto estis semitaj en 96-puta plato, permesitaj alkroĉigi dum la nokto, kaj tiam traktitaj per DEET dum 24 horoj. Post forigo de la kreskmedio, aldonu tinkturbindan solvon al ĉiu puto de la mikroplato kaj kovu la ĉelojn je 37 °C dum 30 min. Fluoreskecaj niveloj estis determinitaj per Mithras LB940-mulreĝima mikroplatleganto (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germanio) ekipita per 485 nm ekscitfiltriloj kaj 530 nm emisiofiltriloj.
HUVEC estis semitaj en 96-putaj teleroj je denseco de 104 ĉeloj per puto. Ĉeloj estis traktitaj kun DEET dum 24 horoj. Ĉela daŭrigebleco estis taksita per kolorimetria MTT-analizo (Sigma-Aldrich, M5655). Optikaj densecaj valoroj estis akiritaj sur multmoda mikroplata leganto (Mithras LB940) je ondolongo de 570 nm.
La efikoj de DEET estis studitaj uzante en vitro angiogenezajn analizojn. Traktado kun 10-8 M aŭ 10-5 M DEET pliigis la formadon de kapilara longo en HUVEC-oj (Fig. 1a, b, blankaj stangoj). Kompare kun la kontrolgrupo, traktado kun DEET-koncentriĝoj intervalantaj de 10-14 ĝis 10-5 M montris, ke la kapilara longo atingis altebenaĵon ĉe 10-8 M DEET (Suplementa Fig. S2). Neniu signifa diferenco estis trovita en la en vitro proangiogena efiko de HUVECs traktitaj kun DEET en la koncentriĝintervalo de 10-8 M kaj 10-5 M.
Por determini la efikon de DEET sur neovaskularigo, ni faris en vivo-neovaskularigajn studojn. Post 14 tagoj, musoj injektitaj kun endoteliaj ĉeloj antaŭkultivitaj kun 10-8 M aŭ 10-5 M DEET montris signifan pliiĝon en hemoglobina enhavo (Fig. 1c, blankaj stangoj).
Krome, DEET-induktita neovaskularigo estis studita en U87MG ksenograft-portantaj musoj kiuj estis injektitaj ĉiutage (ip) kun DEET ĉe dozo konata indukti plasmokoncentriĝojn de 10-5 M, kio estas normala en senŝirmaj homoj. en 23. Rimarkeblaj tumoroj (t.e. tumoroj >100 mm3) estis observitaj 14 tagojn post injekto de U87MG-ĉeloj en musojn. Je la 28-a tago, tumorkresko estis signife plibonigita en musoj traktitaj kun DEET kompare kun kontrolmusoj (Fig. 1d, kvadratoj). Plue, CD31-makulado de tumoroj montris, ke DEET signife pliigis kapilaran areon sed ne mikrovazan densecon. (Fig. 1e–g).
Por determini la rolon de muskarinaj receptoroj en DETA-induktita proliferado, 10-8 M aŭ 10-5 M DETA en la ĉeesto de pFHHSiD (10-7 M, selektema M3-receptorantagonisto) estis uzita. Traktado de HUVEC. pFHHSiD tute blokis la proliferajn ecojn de DETA ĉe ĉiuj koncentriĝoj (Tablo 1).
Sub ĉi tiuj kondiĉoj, ni ankaŭ ekzamenis ĉu DEET pliigus kapilaran longon en HUVEC-ĉeloj. Simile, pFHHSiD signife malhelpis DEET-induktitan kapilaran longon (Fig. 1a, b, grizaj stangoj). Krome, similaj eksperimentoj estis faritaj kun M3 siRNA. Kvankam la kontrolo siRNA ne estis efika por antaŭenigi kapilaran formadon, silentigo de la M3 muskarina receptoro aboliciis la kapablon de DEET pliigi kapilaran longon (Fig. 1a, b, nigraj stangoj).
Krome, ambaŭ 10-8 M aŭ 10-5 M DEET-induktita vaskularigo in vitro kaj neovaskularigo en vivo estis tute blokitaj de pFHHSiD (Fig. 1c, d, cirkloj). Tiuj rezultoj indikas ke DEET antaŭenigas angiogenezon tra pado sentema al selektemaj M3 receptorantagonistoj aŭ M3 siRNA.
AChE estas la molekula celo de DEET. Medikamentoj kiel donepezilo, kiuj funkcias kiel AChE-inhibitoroj, povas stimuli EC-angiogenezon en vitro kaj en musaj malantaŭmembroj iskemiaj modeloj14. Ni testis la efikon de du koncentriĝoj de DEET sur AChE-enzima aktiveco en HUVEC. Malaltaj (10-8 M) kaj altaj (10-5 M) koncentriĝoj de DEET malpliigis endotelian AChE-aktivecon kompare kun kontrolkondiĉoj (Fig. 2).
Ambaŭ koncentriĝoj de DEET (10-8 M kaj 10-5 M) reduktis acetilkolinesterase-agadon sur HUVEC. BW284c51 (10-5 M) estis utiligita kiel kontrolo por acetilkolinesterase-inhibitoroj. Rezultoj estas esprimitaj kiel procento de AChE-agado sur HUVEC traktita kun la du koncentriĝoj de DEET kompare kun veturilo-traktataj ĉeloj. Valoroj estas esprimitaj kiel meznombro ± SEM de ses sendependaj eksperimentoj. *p < 0.05 kompare kun kontrolo (Kruskal-Wallis kaj Dunn multobla kompara testo).
Nitra rusto (NO) estas implikita en la angiogena procezo 33, tial NENIA produktado en DEET-stimulitaj HUVEC-oj estis studita. DEET-traktita endotelia NO-produktado estis pliigita kompare kun kontrolaj ĉeloj, sed atingis signifon nur ĉe dozo de 10-8 M (Fig. 3c). Por determini la molekulajn ŝanĝojn kontrolantajn DEET-induktitan NO-produktadon, eNOS-esprimo kaj aktivigo estis analizitaj per okcidenta makulado. Kvankam DEET-traktado ne ŝanĝis eNOS-esprimon, ĝi signife pliigis eNOS-fosforiladon ĉe ĝia aktiviga loko (Ser-1177) dum malpliigo de ĝia inhibicia loko (Thr-495) kompare al netraktitaj ĉeloj en eNOS-fosforilado (Fig. 3d). Krome, la rilatumo de fosforiligita eNOS ĉe la aktivigloko kaj inhibicia loko estis kalkulita post normaligado de la kvanto de fosforilateita eNOS al la totala kvanto de enzimo. Ĉi tiu proporcio estis signife pliigita en HUVEC-oj traktitaj kun ĉiu koncentriĝo de DEET kompare al netraktitaj ĉeloj (Fig. 3d).
Finfine, la esprimo de VEGF, unu el la ĉefaj proangiogenaj faktoroj, estis analizita per okcidenta makulado. DEET signife pliigis VEGF-esprimon, dum pFHHSiD tute blokis ĉi tiun esprimon.
Ĉar la efikoj de DEET estas sentemaj al kaj farmakologia blokado kaj subreguligo de M3-receptoroj, ni testis la hipotezon, ke DEET povus plibonigi kalcian signaladon. Surprize, DEET malsukcesis pliigi citoplasman kalcion en HUVEC (datenoj ne montritaj) kaj HEK/M3 (Fig. 4a, b) por ambaŭ koncentriĝoj uzitaj.
Afiŝtempo: Dec-30-2024