Pesticidoj ludas kritikan rolon en traktado de tutmondaj manĝaĵmankoj kaj kontraŭbatalado de vektor-portitaj homaj malsanoj. Tamen, la kreskanta problemo de pesticida rezisto urĝe postulas la malkovron de novaj kombinaĵoj, kiuj celas subuzatajn celojn. Insektaj pasemaj receptoraj potencialaj (TRPV) kanaloj - Nanzhong (Nan) kaj neaktivaj (Iav) - povas formi heterologajn kanalojn (Nan-Iav) kaj lokaliziĝi al mekanosensaj organoj, kiuj mediacias geotropismon, aŭdadon kaj propriocepton en insektoj. Kelkaj pesticidoj, kiel ekzemple afidopirolidono (AP), celas Nan-Iav per nekonataj mekanismoj. AP estas efika kontraŭ pik-suĉantaj insektoj (hemipteroj), malhelpante manĝadon per interrompo de la funkcio de la filamentoj. AP povas ligi nur al Nan, sed nur Nan-Iav povas interagi kun agonistoj, inkluzive de endogena nikotinamido (NAM), tiel montrante kanalagadon. Malgraŭ la potencialo de Nan-Iav kiel insekticida celo, malmulte oni scias pri ĝia kanala asembleo, reguligaj liglokoj kaj Ca2+-dependa reguligo, malhelpante plian insekticida disvolviĝon. En ĉi tiu studo, krio-elektrona mikroskopio estis uzata por determini la strukturon de Nan-Iav en Hemipteraj insektoj en la kalmodulin-liganda sen stato, same kiel kun AP kaj NAM ĉe la limo de la ankirina ripetcitoplasma domajno (ARD). Surprize, ni trovis, ke la Nan-proteino mem povas formi pentameron, kiu estas stabiligita per AP-mediaciitaj ARD-interagoj. Ĉi tiu studo malkaŝas molekulajn interagojn inter insekticidoj kaj agonistoj kaj Nan-Iav, elstarigante la gravecon de ARD en kanala funkcio kaj asembleo, kaj esplorante la mekanismon de Ca2+-reguligo.
Kontraŭ la fono de ĉiam pli severa tutmonda klimata ŝanĝo, malboniĝanta tutmonda nutraĵsekureco estas unu el la plej gravaj defioj de la 21-a jarcento, kun kaskadaj sekvoj por la socio.1,2La raporto pri la Stato de Nutraĵsekureco kaj Nutrado en la Mondo 2023 (SOFI) de la Monda Organizaĵo pri Sano taksas, ke proksimume 2.33 miliardoj da homoj tutmonde suferas de modera ĝis severa nutraĵsensekureco, delonga problemo.3,4Bedaŭrinde, oni taksas, ke 20% ĝis 30% aŭ pli da kultivaĵoj perdiĝas ĉiujare pro damaĝbestoj kaj patogenoj, kaj oni atendas, ke tutmonda varmiĝo pliseverigos la reziston al damaĝbestoj kaj la vundeblecon de kultivaĵoj.4,5,6,7,8La disvolviĝo de pesticidoj estas kritika ne nur por protekti kultivaĵojn kontraŭ damaĝbestoj kaj redukti la disvastiĝon de vektor-portitaj patogenoj, sed ankaŭ por kontraŭbatali vektor-portitajn homajn malsanojn kiel dengo-febro, malario kaj ĉagas-malsano, kiuj estas ĉiam pli rezistemaj al pesticidoj.5,9,10,11
Inter la ĉefaj celoj de neŭrotoksaj insekticidoj, la heterotetramera TRPV-kanalo Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) reprezentas klason de insekticidaj celoj malkovritaj nur en la lasta jardeko, inkluzive de komerce haveblaj insekticidoj kiel imidakloprido kaj piraklostrobino.12,13,14La duonsinteza insekticido afidopirolifeno (AP) estas ĵus evoluigita kaj komercigita produkto, kies ĉefa komponanto estas la aktiva insekticido Inscalis®, kiu ligas AP je subnanomola agadnivelo.15AP montras malaltan akutan toksecon al polenigistoj, utilaj insektoj kaj aliaj necelitaj organismoj, kaj kiam uzata laŭ la instrukcioj sur la etikedo, ĝi povas redukti la rezistopremon al aliaj insekticidoj.16,17,18Nan kaj Iav estas vaste distribuitaj tra insektaj specioj, estas kun-esprimitaj nur en kordaj streĉreceptoraj neŭronoj de la antenoj kaj membroj, kaj estas kritikaj por aŭdado, gravitpercepto kaj propriocepto.13,16,19,20,21,22AP, imidakloprido, kaj piraklostrobino stimulas la Nan-Iav-komplekson per unika mekanismo, finfine inhibiciante proprioceptan signal-transdukton.13,16,23Ĉe pik-suĉantaj insektoj (hemipteroj) kiel afidoj kaj blankmuŝoj, perdo de propriocepto difektas ilian manĝokapablon, finfine kondukante al morto.13,24Interese, AP montras altan afinecon por la Nan-Iav-komplekso kaj malaltan afinecon por Nan sole. Ligado de AP al Nan-Iav induktas elektran kurenton, sed ligado al Nan sole ne stimulas kanalan agadon. Iav mem tute ne ligiĝas al AP.16Ĉi tio sugestas, ke Nan kaj Iav povus ligiĝi por formi malsamajn Nan-Iav kanalajn kompleksojn (ekz., kun malsamaj stoiĥiometriaj proporcioj aŭ malsamaj aranĝoj ene de la sama stoiĥiometria proporcio) aŭ ke AP povus ligiĝi al pluraj lokoj. Krome, la natura agonisto nikotinamido (NAM) ligiĝas al Drosophila Nan-Iav kun mikromola afineco, montrante efikojn similajn al tiuj de afidoj (AP) in vitro.16,25kaj malhelpante afidan reproduktadon kaj manĝadon, finfine kondukante al ilia morto25,26Ĉi tiuj datumoj levas multajn demandojn. Ekzemple, restas neklare kiel la Nan-Iav heterodimero formiĝas, kiuj liglokoj estas uzataj por moduli malgrandajn molekulojn, kaj kiel ĉi tiuj malgrandaj molekuloj reguligas kanalfunkcion per subpremado de propriocepto. Krome, la kialoj, kial Nan mem estas neaktiva kaj havas malaltan afinecon por AP, dum la Nan-Iav heterodimero estas aktiva kaj ligas AP kun pli alta afineco, restas neklaraj. Fine, malmulte oni scias pri la Ca2+-dependa reguligo de Nan-Iav funkcio kaj kiel ĝi estas integrita en neŭronajn signalprocezojn.13,21
En ĉi tiu studo, kombinante krio-elektronan mikroskopion, elektrofiziologion, kaj radioligandajn ligteknikojn, ni klarigis la kunmetadon de Nan-Iav kaj la mekanismon de ĝia ligado al reguliloj de malgrandaj molekuloj. Krome, ni detektis konstitue ligitan kalmodulinon (CaM) al Iav kaj AP-stabiligitajn Nan-pentameroj. Ĉi tiuj rezultoj provizas gravajn komprenojn pri la reguligo de kalciaj jonoj en kanaloj, kanala kunmeto, kaj la faktoroj determinantaj ligantan lig-afinecon. Pli grave, ni konfirmis, ke ARD ludas centran rolon en ĉi tiuj procezoj. Nia studo de kompletaj insektaj kanaloj ligitaj al koncernaj agrikulturaj pesticidoj...27, 28, 29malfermas perspektivojn por la disvolviĝo de la pesticida industrio, plibonigante la efikecon kaj specifecon de pesticidoj, kaj ebligante la aplikon de TRPV-celitaj kombinaĵoj al aliaj specioj por trakti tutmondan nutraĵsekurecon kaj la disvastiĝon de vektor-portitaj malsanoj.
Ni ankaŭ trovis, ke Nan-Iav estas reguligita de Ca2+, kaj la mekanismo de reguligo estas mediaciita de konstitue ligita CaM. Grave, ĉi tiu Ca2+-dependa reguligo de Nav fare de CaM signife diferencas de la mekanismoj de reguligo de aliaj jonkanaloj (ekz., tensi-dependaj Na+-kanaloj kaj TRPV5/6-kanaloj).52,53,54,55,56,57En la Nav1.2-kanalo, la C-fina domajno de CaM helikforme asociiĝas kun la C-fina domajno (CTD), kaj Ca2+ induktas ligadon de ĝia N-fina domajno al la distala parto de la CTD.56En la TRPV5/6 kanalo, la C-fina domajno de CaM ligiĝas al CTH, kaj Ca2+ induktas supreniran etendiĝon de ĝia N-fina domajno en la poron, tiel blokante katjonan permeablon.53,54Ni proponas modelon por la Ca2+-reguligita funkcio de Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). En ĉi tiu modelo, la N-fina domajno de CaM konstitutive ligiĝas al la C-fina domajno (CTH) de Iav. En la ripoza stato (malalta [Ca2+] koncentriĝo), la C-fina domajno de CaM interagas kun Nan, stabiligante la ARD-konformacion kaj tiel antaŭenigante kanalmalfermon. Ligado de agonisto/insekticido al la kanalo induktas pormalfermon, kondukante al Ca2+-enfluo. Ca2+ tiam ligiĝas al CaM, kaŭzante disiĝon de la C-fina domajno de la ARD de Nan. Ĉar blokado de CaM-ligado esence forigas la inhibician efikon de Ca2+, ĉi tiu disiĝo modulas ARD-moveblecon, tiel kaŭzante Ca2+-dependan inhibicion aŭ malsentemigon. La rapida reakiro de kanalfluoj post kalcia jona eluado (Fig. 4g) sugestas, ke ĉi tiu mekanismo faciligas rapidajn respondojn al Ca2+-mediaciitaj neŭronaj signaloj. Krome, la C-fina regiono de Iav, kiu restas malbone komprenata, laŭ raportoj ludas aliajn rolojn en kanalcelado kaj nuna reguligo.21
Fine, nia studo prezentas la alt-rezolucian strukturon de insekticida-insekticida TRP-kanala komplekso de agrikultura graveco — malkovro antaŭe nekonata al ni. Rimarkinde, ni karakterizis la strukturon kaj funkcion de la insekta kanalo en homaj ĉeloj (HEK293S GnTi–) anstataŭ en insektaj ĉeloj. Spite al kreskanta insekticida rezisto kaj daŭra premo sur nutraĵsekureco kaj patogenoj, nia laboro provizas gravajn informojn, kiuj faciligos la disvolvon de novaj insekticidoj por la bono de homa sano kaj tutmonda nutraĵsekureco. Studoj montris, ke insekticidoj kiel AP estas efikaj kontraŭ iuj damaĝbestoj kiam uzataj laŭ la instrukcioj sur la etikedo kaj havas malaltan akutan toksecon por utilaj polenigistoj, montrante ilian median sekurecon.13,16Krome, testado de iuj AP-derivaĵoj sur moskitoj montris, ke ili fine perdas sian kapablon flugi. Kompreni kiel ĉi tiuj modulaj kombinaĵoj ligiĝas al Nan-Iav faciligos la modifon de ekzistantaj kombinaĵoj aŭ la disvolvon de novaj kombinaĵoj por pli efikaj kajprecizaplagkontrolo. Nia studo montras, ke la Nan-Iav ARD-interfaco estas kritika ne nur por reguligi la aktivecon de endogenaj kombinaĵoj, pesticidoj kaj Ca2+-CaM, sed ankaŭ por kanala asembleo. Ni sugestas, ke interrompi heterodimeran asembleon per malgrandaj molekuloj povus esti unika kaj promesplena aliro por disvolvi jonkanalajn inhibitorojn.
El la ok ortologaj genoj, la plenlongaj genoj de la bruna skarabo (Halyomorpha halys) Nanchung kaj Inactive estis elektitaj, montrante bonegan stabilecon en lesivoj. La sintezitaj genoj estis kodon-optimumigitaj por homa esprimo kaj klonitaj en la vektoron pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) uzante restriktajn ejojn XhoI kaj EcoRI. Ĉi tio certigis, ke la klonoj estis en kadro kun la C-finaj GFP-FLAG-10xHis kaj mCherry-FLAG-10xHis etikedoj, kiuj estas fenditaj per HRC-3C-proteazo (PPX), permesante sendependan...esprimoLa komenciloj uzitaj por kloni Nanchung kaj Inactive en la vektoron pBacMam estis jenaj:
Mikroskopaj bildoj de individuaj partikloj estis akiritaj per transmisia elektrona mikroskopo (FEI) Titan Krios G2 ekipita per K3-fotilo kaj Gatan BioQuantum-energia filtrilo. La mikroskopo funkciis je 300 keV, kun energia agordo de 20 eV, specimena piksela grandeco de 1,08 Å/pikselo (nominala pligrandigo de 81 000x), kaj malfokusa gradiento intervalanta de -0,8 ĝis -2,2 μm. Videoregistrado estis efektivigita je 40 kadroj por sekundo uzante Latitude S-mikroskopon (Gatan) kun nominala dozofteco de 25 e–px−1 s−1, ekspona tempo de 2,4 s, kaj totala dozo de proksimume 60 e–Å−2.
Radio-induktita moviĝkorekto kaj dozopezo estis faritaj sur filmo uzante MotionCor2 en RELION 4.061. Kontrasta transiga funkcio (CTF) parametro-takso estis farita en cryoSPARC uzante la peceto-bazitan CTF-taksadmetodon62. Mikrofotoj kun CTF-adapta rezolucio ≥4 Å estis ekskluditaj de posta analizo. Tipe, subaro de 500–1000 mikrofotoj estis uzata por punkta selektado en cryoSPARC, sekvata de pluraj rondoj de 2D klasifiko post filtrado por akiri klaran referencan bildon por ŝablon-bazita partikla selektado. Partikloj tiam estis ekstraktaj uzante 64-pikselajn limskatolojn kaj 4-oblan kombinadon. Pluraj rondoj de 2D klasifiko estis faritaj por forigi nedeziratajn partiklajn kategoriojn. La komenca 3D modelo estis rekonstruita uzante ab initio rekonstruon kaj rafinita uzante neunuforman rafinadon en cryoSPARC. 3D klasifiko estis farita en cryoSPARC aŭ RELION surbaze de ARD-heterogeneco. Neniu signifa heterogeneco de membranaj domajnoj estis observita. Partikloj estis rafinitaj uzante la C1 kaj C2 metodojn; Partikloj kun pli alta C2-rezolucio estis konsiderataj simetriaj rilate al C2 kaj importitaj en RELION por bajesa rafinado. La partikloj estis poste translokigitaj reen al cryoSPARC por fina neunuforma kaj loka rafinado. La fina rezolucio kaj partiklaj nombroj estas montritaj en Tabelo 1.
Prilaborante Nan+AP-pentamerojn, ni esploris diversajn metodojn por plibonigi la distingivon de membranaj domajnoj (precipe la porregiono), kiel ekzemple signalsubtraho kaj TMD-maskado. Tamen, ĉi tiuj provoj malsukcesis pro la eble ekstrema malordo en la porregiono kaj la ĝenerala diverseco de la TMD. La fina distingivo estis kalkulita uzante maskon aŭtomate generitan per la neunuforma prilabora metodo en cryoSPARC, ĉefe celante la ARD-regionon. Ĉi tio atingis signife pli altan distingivon ol tiu de la membranaj domajnoj (precipe la VSLD-regiono).
Komencaj *de novo* modeloj de la apo-formoj de la Nanchung kaj Inactive-cimoj estis unue generitaj uzante Coot63, kaj modeloj de la Nan kaj Iav-cimoj estis generitaj uzante AlphaFold264 por identigi malalt-fidajn regionojn. Kalmodulina modelado baziĝis sur rigid-korpaj alĝustigoj de la Ca2+-ligaj kaj Ca2+-liberaj modeloj en PDB-aldonaĵoj 4JPZ56 kaj 1CFD65, respektive. La modeloj estis rafinitaj uzante sferan rafinadon por certigi la ĝustan stereokemion kaj bonan geometrion. Fosfatidilkolino, fosfatidiletanolamino, kaj fosfatidilserino estis poste modelitaj kiel bone difinitaj lipidaj densecoj, kaj la NAM kaj AP-ligandoj estis metitaj en la respondajn densecoj en la mallozaj krucvojoj. Limdosieroj estis generitaj el la SMILES-ĉeno de la izoformoj uzante eLBOW en PHENIX66. Fine, la modeloj estis rafinitaj en reala spaco en PHENIX uzante lokan kradan serĉon kaj tutmondan minimumigon kun limigoj de sekundara strukturo. La servilo MolProbity estis uzata por modelrafinado kaj struktura analizo, kaj ilustraĵoj estis faritaj uzante PyMOL kaj UCSF Chimera X. 67,68,69 Aperturanalizo estis farita uzante la servilon HOLE, 70 kaj sekvenckonservada mapado estis farita uzante la servilon Consurf. 71
Statistika analizo estis farita per Igor Pro 6.2, Excel Office 365, kaj GraphPad Prism 7.0. Ĉiuj kvantaj datumoj estas prezentitaj kiel meznombro ± norma eraro (SEM). Studenta t-testo (duflanka, nepara) estis uzata por kompari du grupojn. Unudirekta variancanalizo (ANOVA) sekvata de Dunnett post hoc testo estis uzata por kompari plurajn grupojn. *P< 0,05, **P< 0,01, kaj ***P< 0,001 estis konsiderataj statistike signifaj depende de la datendistribuo. Kd, Ki-valoroj, kaj iliaj nesimetriaj 95%-konfidencintervaloj estis kalkulitaj uzante GraphPad Prism 10.
Por pliaj detaloj pri la studmetodaro, bonvolu vidi la Resumon de la Raporto pri Naturportfolio ligitan en ĉi tiu artikolo.
La komenca modelo estis konstruita uzante la kalmodulinajn modelojn el la datumbazoj PDB 4JPZ kaj 1CFD. La koordinatoj estis deponitaj en la Protein Data Bank (PDB) sub la surskribaj numeroj 9NVN (Nan-Iav-CaM sen ligando), 9NVO (Nan-Iav-CaM ligita al nikotinamido), 9NVP (Nan-Iav-CaM ligita al nikotinamido kaj EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM ligita al afenidolpirolino kaj kalcio), 9NVR (Nan-Iav-CaM ligita al afenidolpirolino kaj EDTA), kaj 9NVS (Nan-pentamero ligita al afenidolpirolino). La respondaj krio-elektronmikroskopiaj bildoj estas deponitaj en la Elektronmikroskopia Datumbazo (EMDB) sub la jenaj surskribnumeroj: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sen ligando), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-komplekso kun nikotinamido), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-komplekso kun nikotinamido kaj EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-komplekso kun afidopirolino kaj kalcio), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-komplekso kun afidopirolino kaj EDTA), kaj EMD-49849 (Nan-pentamera komplekso kun afidopirolino). La krudaj datumoj por la funkcia analizo estas prezentitaj en ĉi tiu artikolo.
Afiŝtempo: 28-a de januaro 2026